في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

العام من هذا في نهج التثقيب الكهربائي للرحم هو توصيف الاتصال الهيكلي واستثارة الخلايا العصبية القشرية في ظل الظروف العادية والتجريبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب التنموي ، مثل تشريح البنية والاتصال الوظيفي للدماغ وبيولوجيا الاضطرابات المعرفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتمييز مجموعة متفرقة من الخلايا العصبية وتسمح لك بارتداء التشعبات والوصول إلى الخلايا العصبية الفردية مما يؤدي إلى تحليل كمي أكثر كفاءة وأكثر فيمية.

قبل الحقن ، قم بإعداد عشرة ميكرولترات من خليط الحمض النووي لكل عملية جراحية إما لوضع العلامات على الخلية المفردة أو دراسة مشبك التصحيح القياسية. بعد ذلك ، قم بمعالجة الأجنة برفق بأصابعك لتحديد موقع telencephalon. بعد ذلك ، ضع الشعيرات الدموية البورسليكات المحضرة في ماصة الفم.

مرر طرف الإبرة عبر الرحم ، وتجنب الأوعية الدموية ، حتى تصل إلى البطين الجانبي. بعد ذلك ، قم بحقن ما يقرب من ميكرولتر واحد من محلول الحمض النووي الملون باللون الأخضر السريع ببطء حتى يتم ملاحظة بقعة زرقاء كبيرة. خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي حقن الحمض النووي.

يجب أن يتم ذلك بلطف قدر الإمكان. الآن ، ضع الأقطاب الكهربائية البلاتينية التي يبلغ قطرها سبعة ملليمترات بشكل جانبي على رأس الجنين وقم بتطبيق الجهد عبر أقطاب البلاتين. في هذا الإجراء ، قم بالتبريد بحماية الأدمغة الثابتة في عشرة ملليلترات من 30٪ سكروز في PBS عند أربع درجات مئوية لمدة يوم إلى يومين حتى تغرق.

ثم قم بإعداد مكعبات من رقائق الألومنيوم بحجم سنتيمتر مكعب واملأ المكعبات 2/3 أو بالطريقة ب OCT. بعد ذلك ، ضع الأدمغة في المكعبات وقم بتجميدها على الثلج الجاف. بعد ذلك قم بتخزين الأدمغة المجمدة عند 80 درجة مئوية.

لتقسيم الأدمغة في ناتج البرد ، ضع قطرة من OCT على سطح قرص العينة. قشر رقائق الألومنيوم من كتلة الأنسجة وضع الكتلة في الاتجاه المطلوب أعلى السائل OCT. اضغط بقوة حتى يتم إصلاح الكتلة النسيجية.

ثم أدخل قرص العينة في رأس العينة من ناظم البرد وقم بتوجيه العينة للتقسيم. ثم قم بتقطيع أقسام بسمك 50-100 ميكرومتر وانقل المقاطع البردية العائمة إلى PBS باستخدام فرشاة دقيقة. بعد ذلك ، قم بسد الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مصل بقري جنيني 5٪ في PBS ، يحتوي على 0.5٪ Triton X-100.

بعد ذلك ، احتضنها طوال الليل عند أربع درجات مئوية مع 1: 500 جسم مضاد أولي مخفف في محلول حجب في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات في PBS. أضف 1: 500 من الجسم المضاد الثانوي المخفف في محلول مانع واحتضان الأقسام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات في PBS. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام التي تحتوي على dapE في PBS التي تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 لمدة عشر دقائق. شطف الأقسام مع PBS وقم بتثبيتها مع وسيط تثبيت.

لإعادة بناء الخلايا العصبية ، احصل على صور لأقسام الدماغ بتكبير عال ودقة عالية. بعد ذلك، حدد فحص التجانب في برنامج الاستحواذ لتغطية مجال الاهتمام، الذي يمتد عبر جميع التشعبات والعمليات المحورية. احصل على عدد كاف من المكدسات على المحور Z لتجنب فقدان المعلومات.

بعد ذلك ، افتح الصورة وحدد خيار الخط المجزأ من القائمة. ارسم خطا يتبع بنية الخلايا العصبية. بعد ذلك ، انتقل إلى التحليل ، الأدوات ، متبوعا بمدير عائد الاستثمار ، ثم إضافة لحفظ السطر.

كرر هذه العملية لكل محور عصبي أو تغصنات من الخلايا العصبية التي تم تحليلها. في قائمة مدير عائد الاستثمار، اضغط على قياس للحصول على الطول. تصدير القياسات إلى ملف نصي أو جدول بيانات لتحليلها.

لإجراء تسجيل للخلايا العصبية المعبر عنها GFP من فأر GFP الكهربائي ، ضع الدماغ في طبق مزرعة مبرد. قطع المخيخ بمقص صغير. ثم التقط الدماغ بملعقة وجففه على منشفة ورقية.

ألصق المستوى الذيلي البطني للدماغ على حامل الاهتزاز. ضع الحامل على Vibratome مملوء ب ACSF المثلج وتأكد من أن حجرة الاهتزاز بها كربوجين مستمر. بعد ذلك ، احصل على شرائح حادة عن طريق قطع 300 ميكرومتر من الأقسام الإكليلية في غضون 15 دقيقة.

بعد ذلك ، احتضان الشرائح الحادة عند 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل في ACSF أثناء غلي الكربوجين. بعد 60 دقيقة ، انقل شريحة إلى غرفة التسجيل باستخدام ماصة باستور أو فرشاة صغيرة. اضغط على الشريحة بقيثارة وقم بغزارة باستخدام ACSF بمعدل ملليلترين في الدقيقة.

لتصحيح خلية عصبية إيجابية GFP ، حدد موقع منطقة الاهتمام من خلال المجهر عند 10x. ثم ابحث عن خلية موجبة GFP باستخدام الهدف 60x. بعد ذلك ، املأ قطب التسجيل بمحلول داخل الخلايا.

بعد ذلك، ضع ماصة زجاجية في حامل الماصة. بعد ذلك ، ضع طرف الماصة في الحمام وركز على الحافة. بمجرد أن تكون الماصة في الحمام، قم بالضغط الإيجابي من خلال نظام التحكم في الضغط الخلفي.

اقترب من الخلية ذات الأهمية تحت التوجيه البصري مع الحفاظ على الضغط الخلفي في الماصة. عند ظهور غمازة صغيرة على سطح الخلية ، حرر الضغط. في هذه المرحلة ، قد يتم تشكيل ختم محكم بمقاومة أكبر من جيجا أوم.

خلاف ذلك ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف لتسهيل ذلك. أثناء تشكيل الختم ، قم بإحضار مشبك الجهد الثابت إلى 60 مللي فولت. بمجرد تشكيل ختم جيجا أوم ، قم بتطبيق نبضة شفط لتمزيق غشاء الخلية واقتحام وضع الخلية بالكامل.

بمجرد أن يكون في وضع الخلية بالكامل ، قم بالتبديل من مشبك الجهد إلى وضع المشبك الحالي وابدأ التسجيل. تظهر هذه الصور توصيل النواقل إلى طبقة 2/3 من الخلايا العصبية عن طريق التثقيب الكهربائي في الرحم في اليوم الجنيني 15.5 ، وتم تحضير الأقسام الإكليلية في اليوم 16 بعد الولادة. تم نقل متجه CAG DsRed2 كعنصر تحكم.

يتم التعبير عن GFP فقط في تلك الخلايا العصبية التي أدرجت أيضا cre ، مما يسمح بإعادة تركيب مواقع LoxP في ناقل CALNL GFP. فيما يلي صورة متحدة البؤر عالية التكبير للعرش المتغصنة لخلية عصبية GFP أخرى ذات علامات ضئيلة. هذه خلية عصبية هرمية مكهربة باستخدام GFP والتي لوحظت في ظل الحقول الساطعة وظروف التألق الأخضر.

فيما يلي استجابة متصاعدة نموذجية ومنتظمة لخلية عصبية التحكم الكهربائية CAG-GFP في الطبقة 2/3. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة للتثقيب الكهربائي في الرحم ونصف يوم لتسجيل مشبك التصحيح إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إجراء الجراحة في أسرع وقت ممكن لتقليل إجهاد الأم وزيادة فرص بقاء الجراء.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التعبير من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل العلاقة بين التعبير عن جينات معينة وتأثيرها في تطوير البديل. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب التنموي لاستكشاف الاتصال ومورفولوجيا الخلايا العصبية في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدامها في عملية الرحم لوصف بنية واتصال الخلايا العصبية على مستوى الخلية المفردة واستثارة الخلايا العصبية المسماة بالفلورسنت.