تشخيص الرواية في مراجعة تقويم مفاصل: زرع Sonication ومتعدد تفاعل البوليميراز المتسلسل

الهدف العام من الإجراءات الموضحة باستخدام سحب السوائل المفصلية، وتفاعل البوليميراز المتسلسل المتعدد، والمعالجة بالموجات فوق الصوتية هو تقديم نتائج ميكروبيولوجية سريعة وموثوقة لجراحي العظام في حالات الاشتباه في وجود عدوى حول المفصل الاصطناعي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال التشخيصي والعلاجي لعدوى حول المفصل الاصطناعي، مثل الكشف المبكر عن المسببات المرضية، وبالتالي بدء العلاج الموجه المبكر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنيات في تقديم نتائج فورية.

يمكن لهذه العملية تسريع التشخيص التفريقي في حالات الاشتباه في وجود عدوى حول مفصل اصطناعي. يتم وضع المريض في وضعية الاستلقاء الظهري على سرير الفحص. وفي حال الرغبة في إجراء بزل للركبة، توضع لفافة تحت ركبة المريض بحيث تكون الركبة في وضعية ثني طفيفة.

استخدم مقصاً كهربائياً لتقصير شعر الجسم الكثيف أو الطويل. ثم قم بتجهيز طاولة الأدوات والتحضير للجراحة وفقاً للبروتوكول النصي. بعد ذلك، استخدم مطهراً جلدياً لغسل جلد المريض جيداً عند موقع الوخز.

قم بتغطية موقع الوخز باستخدام غطاء معقم ذي فتحة. ثم حدد موقع الوخز من خلال الغطاء. وباستخدام شفرة مشرط مدببة، قم بإجراء شق طعني صغير عبر الجلد في موقع الشق.

قم بتثبيت القنية في وصلة لوير (luer-slip) الخاصة بالسرنجة. ثم أدخل القنية من خلال شق الوخز. وعند الرتج العلوي لمفصل الركبة، وجه الإبرة بزاوية 45 درجة نحو الجهة الظهرية والإنسية باتجاه الرتج، أسفل القطب العلوي للرضفة، ثم أدخل الإبرة إلى عمق 5 cm تقريبًا.

قم بشفط السائل المفصلي عن طريق سحب مكبس المحقنة. ولمنع تكون التجمعات الدموية، ضع ضمادة، ثم اتبعها بلفافة على موقع الشق الجراحي. استخدم مطهراً كحولياً لتطهير غشاء قارورة زراعة الدم الخاصة بالأطفال.

بعد ذلك، ضع كانيولا جديدة على المحقنة واحقن من 1 إلى 3 mL من سائل المفصل الذي تم سحبه في القارورة. امزج المزيج عن طريق الرج الخفيف أو التدوير. ولتحضير عينة سحب مفصلية طبيعية، قم بإزالة الكانيولا من المحقنة.

ثم افتح أنبوب جمع دم خالٍ من المضافات واحقن 1 mL من السائل المشفوط في أنبوب الجمع. أعد تركيب الغطاء وأحكم إغلاقه لتحليل PCR. انقل من 1 إلى 4 mL من سائل المفصل المشفوط إلى أنبوب جمع دم يحتوي على EDTA لإجراء عد الخلايا وتمايزها.

قم بإذابة أنبوب المزيج الرئيسي (master mix) عن طريق وضعه في درجة حرارة الغرفة. انقُل 180 mcL من العينة التي تم جمعها إلى أنبوب العينة. أغلق أنبوب العينة باستخدام غطاء أنبوب العينة الذي يحتوي على البروتين كيناز K وجين تحكم داخلي لمراقبة جودة سير العمل بالكامل.

عند لوحة التحكم، افتح برنامج التشغيل عن طريق لمس زر New Test في الزاوية السفلية اليسرى. استخدم شاشة اللمس لإدخال بيانات المريض أو معرف العينة (sample ID). لاختيار العينة من القائمة المنسدلة، اختر أولاً ITI Cartridge، ثم Orthopedics كوضع للتطبيق (application mode)، وأخيراً، اختر Synovial Fluid أو Sonication Fluid كنوع للعينة. ثم اضغط على زر Start.

قم بمسح الرمز الشريطي الموجود في أسفل أنبوب العينة. ثم أدخل أنبوب العينة في جهاز Lysator. بعد ذلك، حدد العينة على شاشة وحدة التحكم لفك قفل أنبوب العينة من جهاز Lysator.

ثم قم بإزالة أنبوب العينة من جهاز Lysator وأغلق الغطاء العلوي للجهاز. انقل أنبوب العينة إلى فتحة أنبوب العينة في خرطوشة PCR. بعد ذلك، أدخل أنبوب المزيج الرئيسي (master mix) الذي تم إذابته في فتحة المزيج الرئيسي في خرطوشة PCR.

اتبع التعليمات الظاهرة على شاشة وحدة التحكم لمسح خرطوشة PCR التي تحتوي على المزيج الرئيسي وأنبوب العينة. أدخل خرطوشة PCR في فتحة الخرطوشة المحددة في جهاز التحليل. من شاشة اللمس في وحدة التحكم في الزاوية السفلية اليسرى، اختر الاختبارات النشطة (Active Tests)، ثم حدد معرف العينة الصحيح لعرض نتائج الاختبار.

احفظ النتائج في ذاكرة الجهاز وقم بطباعتها أو تصديرها للرجوع إليها لاحقًا. تحدث مع أخصائي الأحياء الدقيقة وأطلعه على تفاصيل الحالة، ليكون مستعدًا لتحليل العينات على الفور. تحت بنش عمل ذو تدفق هواء صفائحي، افتح الحاوية البلاستيكية التي تحتوي على الطرف الاصطناعي المستأصل من غرفة العمليات، وأضف محلول كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% حتى يتم تغطية الجسم الغريب المستأصل بنسبة 80% على الأقل. أغلق الحاوية البلاستيكية.

بعد ذلك، قم برج أو تحريك الحاوية البلاستيكية جيداً لمدة 30 ثانية. انقل الحاوية البلاستيكية إلى حمام الموجات فوق الصوتية (sonication bath). ثم تحقق من مستوى السائل في الحمام.

قم بمعالجة العينة بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق، بتردد 40 ± 2 kHz وكثافة قدرة تبلغ 0.22 ± 0.04 W/cm². بعد ذلك، قم برج العينة أو مزجها جيداً باستخدام جهاز Vortex لمدة 30 ثانية. داخل كابينة التدفق الصفائحي، اجمع 50 mL من سائل المعالجة بالموجات فوق الصوتية وانقله إلى أنبوب معقم قبل إغلاق الأنبوب بإحكام.

لتحضير سائل سونيكة مركز، قم بطرد مركزي للأنبوب عند 4200 ×g لمدة 10 دقائق، مع ترك حجم متبقٍ قدره 10 mL، واستخدم الماصة للتخلص من السائل الطافي المتبقي. أعد تعليق الراسب عن طريق الماصة والخلط الدوامي. قم بتلقيح كل قارورة من أوساط الزرع المناسبة بـ 0.5 mL من سائل السونيكة المركز.

قم بتلقيح قارورة زراعة الدم للأطفال بـ 2 mL من سائل السونيكاسيون المركز كما تم توضيحه مسبقاً في هذا الفيديو. بعد ذلك، انقل 1 mL من سائل السونيكاسيون المركز إلى أنبوب معقم خالٍ من الإضافات لإجراء تحليل PCR. انقل أوساط الزراعة الملقحة إلى الحاضنة.

قم بتحضين المزارع لمدة 14 يوماً وتحقق من النمو يومياً. يُعتبر وجود عدوى مفصل حول بدلة مفصلية مؤكداً عند تحقق معيار رئيسي واحد أو ثلاثة على الأقل من خمسة معايير فرعية. تشمل المعايير الرئيسية وجود ناسور أو اكتشاف مسبب مرض في عينتين ميكروبيولوجيتين منفصلتين.

تشمل المعايير الثانوية وجود عدد خلايا إيجابي أو تمايز خلوي إيجابي في سائل المفاصل المشفوط، أو نتائج إيجابية لبروتين C التفاعلي (CRP) ومعدل ترسب كريات الدم الحمراء في عينات الدم، أو نتائج نسيجية إيجابية في عينات الأنسجة، أو اكتشاف عامل ممرض في عينة ميكروبيولوجية واحدة فقط. وأظهرت النتائج هنا حساسية متوسطة لتشخيص PCR في سائل التنظيف بالموجات فوق الصوتية وسائل المفاصل المشفوط، ولكنها أظهرت نوعية قوية جدًا بلغت 100%. وكلما أظهر اختبار PCR نتيجة إيجابية في سائل المفاصل المشفوط أو سائل التنظيف بالموجات فوق الصوتية، تم اكتشاف العامل الممرض نفسه لاحقًا في إحدى المزارع الميكروبيولوجية التقليدية. كما لم تظهر نتائج PCR للعينات المختلفة في الحالات غير المصابة بأي نتائج إيجابية كاذبة.

لقد أخفق الكشف بواسطة PCR في تحديد ستة من أصل 16 ممرضاً حقيقياً في عينات سائل السونيكيشن، وخمسة من أصل 13 ممرضاً من مزرعة السائل المفصلي. وقد حددت تشخيصات PCR المجمعة لكلا المادتين، وهي سحب السائل المفصلي وسائل السونيكيشن، 12 من أصل 18 حالة عدوى بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحسين مسار التشخيص في حالات عدوى المفاصل حول البدائل الاصطناعية.

يمكنك أن ترى كيف يجب على علماء الأحياء الدقيقة وجراحي العظام العمل معاً بشكل وثيق لتحسين التشخيص التفريقي قدر الإمكان. إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح، فستحصل على نتائج ذات قيمة سريرية من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) متعدد الإرسال القائم على الخرطوشة في غضون خمس ساعات بعد سحب سائل المفصل. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بطريقة معقمة طوال العملية.

لا تنسَ أن العمل مع عينات الأنسجة البشرية أو العينات الميكروبيولوجية يمكن أن يكون خطيراً للغاية. يجب دائماً اتخاذ كافة الاحتياطات، مثل معدات الوقاية الشخصية، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.