التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

البروتينات المستجيب البكتيرية مهمة لتأسيس العدوى الناجحة. يصف هذا البروتوكول تحديد التجريبي للشركاء ملزم البروتينية من بروتين المستجيب البكتيرية في مضيف النباتات الطبيعية لها. أصبح تحديد هذه التفاعلات المستجيب عبر الخميرة الشاشتين الهجين أداة مهمة في كشف استراتيجيات المرضية الجزيئية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو كشف الاستراتيجيات الخبيثة وأنظمة مسببات الأمراض المضيفة من خلال تحديد تفاعل بروتين الفيتوبلازما المبيض مع البروتينات المضيفة من malus domestica. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العديد من مجالات البحث البيولوجي المختلفة ، وتستخدم هنا في أبحاث النبات لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مرض انتشار التفاح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن فحص مستجيب ممرض واحد ضد الآلاف من المتفاعلات المحتملة ، مما يجعل هذه الطريقة نقطة انطلاق سهلة الاستخدام في أبحاث العدوى.

للبدء ، حدد الأشجار المصابة بأعراض محددة لانتشار التفاح وتحكم في الأشجار الخالية من الأعراض. باستخدام مقصات نظيفة ، قم بقطع عينات الجذر من ثلاثة مواقع مختلفة لنظام الجذر يبلغ قطرها 0.5 1 سم وطولها حوالي 5 سم. ضع عينات الجذر في أكياس بلاستيكية ذات علامات مناسبة.

ثم ضع العينات في صندوق بارد به عبوات حرارية مبردة وقم بتخزينها على أربع درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة. شطف عينات الجذر بالماء لإزالة التربة. ثم انقل العينات إلى طبق بتري معقم واستخدم مشرطا معقما لإزالة بشرة الجذر والقشرة.

باستخدام منديل نظيف وخالي من النسالة ، امسح المشرط. ثم اغمس الأداة في 70٪ من الإيثانول وقم بتعقيمها بالحرارة على لهب مكشوف. استخدم المشرط لخدش اللحاء.

قطعي العينة إلى قطع صغيرة وضعي 30-100 ملليغرام من القطع في أنبوب تفاعل معقم بحجم ملليلتر. قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية أو استخدمها على الفور لعزل الحمض النووي ، والذي يعمل كنموذج لتضخيم الجينات المستجيب والاستنساخ اللاحق للمستجيب في ناقل الطعم. بعد عزل الحمض النووي متعدد الأنواع النباتي من الأشجار المصابة ، استنساخه في نواقل الطعم واختباره للتنشيط الذاتي والتعبير وفقا لبروتوكول النص.

مستجيب Streak plex A ATP 00189 بتحويل NMY51 إلى لوحة SD-trp جديدة وزرعها عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تظهر مستعمرات حمراء. استخدم مستعمرة حمراء من صفيحة أجار لتلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط SD-trp في قارورة اهتزاز صغيرة واحتضان المزرعة طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 120-150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، باستخدام مليلتر واحد من المزرعة الليلية ، قم بتلقيح 20 مل من SD-trp في قارورة اهتزازية واتركها تنمو لمدة ثماني ساعات.

استخدم وسيط SD-trp لضبط المزرعة على OD600 من 0.2 ، ومع عشرة ملليلتر من المزرعة ، قم بتلقيح قارورتين تحتويان على 100 مل لكل منهما من وسط SD-trp. احتضان الثقافات عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز طوال الليل. بعد ذلك ، قم بقياس OD600 للثقافة والحبيبات 120 OD600 وحدة.

على سبيل المثال ، إذا تم قياس OD600 من 1.2 ، فقم بتدوير 100 مل من العينة ، وتخلص من المادة الطافية ، واستخدم 800 مل من 2xYPAD الدافئ مسبقا لإعادة تعليق الحبيبات إلى قارورتين شاكر واحتضانها عند 30 درجة مئوية. احتضان استزراع الخميرة عند 30 درجة مئوية و 120-150 دورة في الدقيقة. قم بقياس OD600 كل 1.5 ساعة تقريبا وفقا لبروتوكول النص حتى يتم الوصول إلى OD600 من 0.6.

بعد تحضير الحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون ، Te Lithium OAc و PEG Lithium OAc وفقا لبروتوكول النص ، يقوم الطرد المركزي ب 800 مل من زراعة الخميرة عند 700 × جم لمدة خمس دقائق لحبيبات الخلايا. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الكريات في إجمالي 200 مل من الماء المقطر المزدوج المعقم. ثم قم بتخريب الخلايا مرة أخرى وتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في 16 مل من مزيج Te Lithium OAc وقم بتدوير العينة مرة أخرى. ثم بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم 9.6 مل من Te Lithium OAc لإعادة تعليق الحبيبات. في أوعية التفاعل ذات الحجم المناسب ، قم بإعداد اثني عشر قارورة مع سبعة ميكروغرامات من ذروة إضافة ناقل مكتبة الحمض النووي HAC ، و 100 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون بنسبة 2٪ ، و 2.5 مل من مزيج PEG Lithium OAc.

أضف 600 ميكرولتر من معلق خلية الخميرة المعد مسبقا إلى كل من القوارير الاثني عشر واخلطها بقوة لمدة دقيقة واحدة. ثم احتضان التفاعلات في حمام مائي عند 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ، واخلطها كل 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 160 ميكرولتر من DMSO إلى كل قارورة واخلطها بقوة.

ثم احتضن القوارير على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إضافية. بعد تكوير الخلايا ، تخلص من المادة الطافية واستخدم ثلاثة ملليلتر من 2xYPAD لإعادة تعليق كل بيليه. قم بتجميع الخلايا من جميع القوارير الاثني عشر في قارورة شاكر سعة 100 مل واحتضان الخميرة لمدة 90 دقيقة عند 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، بعد تكوير الخلايا والتخلص من المادة الطافية ، استخدم ماصة مصلية سعة عشرة ملليلتر و 4.5 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ لإعادة تعليق الحبيبات تماما عن طريق سحب العينة بعناية لأعلى ولأسفل. اسحب 50 ميكرولتر من المعلق واستخدم 0.9٪ كلوريد الصوديوم لتحضير تخفيفات عشرة أضعاف من 1:10 إلى 1:1000. ثم قم بلوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أطباق بتري مقاس 90 ملم تحتوي على SD-trp-leu agar.

انشر باقي تعليق الخميرة غير المخفف على أطباق بتري بقطر 16 × 150 ملم باستخدام SD-trp-leu-His-ade agar. احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام لألواح SD-trp-leu ولمدة أربعة أيام لألواح SD-trp-leu-his-ade. حدد كفاءة التعدي عن طريق حساب مستعمرات التخفيفات التسلسلية المختلفة على لوحات اختيار SD-trp-leu.

انقل كل استنساخ باستخدام طرف ماصة معقم لالتقاط المستعمرة وترسبها على ألواح انتقائية جديدة من SD-trp-leu-his-ade. احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. كرر نقل المستنسخة كل يوم حتى يتم الوصول إلى ما مجموعه خمسة مقاطع.

لتحليل المستنسخة ، تحت غطاء معقم ، قم بإعداد أنبوب تفاعل معقم بسعة ملليلترين مع مليلتر واحد من SD-trp-leu-his-ade لكل استنساخ. استخدم إبرة ساخنة لعمل ثقب في كل أنبوب واستخدم مادة مانعة للتسرب للغاز لتغطية الفتحة. قم بتلقيح كل قارورة بمادة مستعمرة جديدة من استنساخ واحد واحتضان القوارير عند 30 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.

بعد تكوير الخلايا والتخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات في المخزن المؤقت المناسب وانقلها إلى أنبوب تفاعل جديد سعة ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض إلى التعليق واخلط الأنبوب بقوة لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بتنقية الحمض النووي البلازميد وفقا لبروتوكول النص.

توفير ملخص للنتائج المتوقعة لمقايسة التنشيط الذاتي وتفسيرها في هذا الجدول والشكل. يؤدي التنشيط الذاتي الضعيف إلى النمو على trp-leu-his ، ولكن ليس على لوحات الاختيار المستنفدة trp-leu-his-ade. في حين أن الخميرة التي تحولت بطعم قوي ذاتي التنشيط ستنمو على trp-leu-his-ade التي تفتقر إلى الوسط.

يتميز التحول المشترك الناجح للطعم والفريسة بالنمو على صفائح انتقائية تفتقر إلى trp و leu. يؤدي تفاعل الطعم وبروتين الفريسة إلى استكمال أوكستروفي NMY51 الموضح هنا مثال على التفاعل بين الطعم والفريسة في تجربة الخميرة 2 الهجينة. تم تحديد شركاء التفاعل المضيف malus domestica ، MdTCP24 و MdTCP25 وتم تأكيد التفاعل من خلال التحول المخروطي denovo مع المستجيب.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هجين الخميرة 2 في يوم واحد إذا تم إعداد جميع المعدات والمواد اللازمة ، وخاصة الخميرة ، مسبقا بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تجنب التلوث والعمل دائما في ظل ظروف معقمة. باتباع هذا الإجراء ، يجب تنفيذ طريقة مستقلة أخرى مثل تكميل التألق ثنائي الجزيئات على سبيل المثال ، لتأكيد تفاعلات البروتين والبروتين الموجودة.

هذا مهم بشكل خاص لأن الخميرة أو الهجين في حد ذاته عرضة نسبيا لتوليد نتائج إيجابية خاطئة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في العديد من مجالات البحث المختلفة لفهم المبادئ الجزيئية التي تنطوي على تفاعلات البروتين والبروتين بشكل أفضل ، خاصة في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض ، والعديد من مجالات البحث البيولوجية الأخرى. علاوة على ذلك ، ستفهم أن تنفيذ هذه الطريقة ممكن بسهولة في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية مجهز بشكل لائق.

لا تنس أن العمل مع بعض المواد الكيميائية والمشارط واللهب المكشوف يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وبالتالي عند تنفيذ هذا الإجراء ، عليك دائما مراعاة بعض الاحتياطات. وهذا يعني استخدام معدات السلامة الشخصية الخاصة بك مثل القفازات والنظارات الواقية ، واستخدام معدات السلامة العامة في المختبرات.