التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

إن الهدف العام من هذا الإجراء هو كشف الاستراتيجيات الضارية وأنظمة المضيف والممرض من خلال تحديد التفاعل بين بروتين candidatus phytoplasma malefactor وبروتينات المضيف من نوع malus domestica. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في العديد من المجالات البحثية البيولوجية المختلفة، وتُستخدم هنا في أبحاث النبات لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور مرض تكاثر التفاح. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية فحص تأثير ممرض واحد مقابل الآلاف من المتفاعلات المحتملة، مما يجعل هذه الطريقة نقطة انطلاق قابلة للتنفيذ بسهولة في أبحاث العدوى.

للبدء، حدد الأشجار المصابة بأعراض مرض تكاثر التفاح (Apple Proliferation) المحددة، والأشجار الخالية من الأعراض كمجموعة ضابطة. وباستخدام مقصات تقليم نظيفة، اقتطع عينات من الجذور من ثلاثة مواقع مختلفة من المجموع الجذري بقطر يتراوح بين 0.5 1 cm، وطول يبلغ حوالي 5 cm. ثم ضع عينات الجذور في أكياس بلاستيكية تحمل ملصقات تعريفية مناسبة.

بعد ذلك، ضع العينات في صندوق تبريد يحتوي على عبوات حرارية مبردة واحفظها عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم معالجتها لاحقاً. اغسل عينات الجذور بالماء لإزالة التربة، ثم انقل العينات إلى طبق بتري معقم واستخدم مشرطاً معقماً لإزالة بشرة الجذر والقشرة.

باستخدام منديل نظيف وخالٍ من الوبر، امسح المشرط. ثم اغمس الأداة في إيثانول 70% وعقمها حرارياً فوق لهب مكشوف. استخدم المشرط لخدش اللحاء.

قم بتقطيع العينة إلى قطع صغيرة وانقل مقدار 30-100 مليغرام من هذه القطع إلى أنبوب تفاعل معقم سعة 2 ملي لتر. تُحفظ العينات في درجة حرارة 80 درجة مئوية أو تُستخدم فوراً لعزل DNA، والذي يعمل كقالب لتضخيم جين المؤثر (effector gene) ومن ثم استنساخه في ناقل الطعم (bait vector). بعد عزل DNA متعدد النوعية للفيتوبلازما (phytoplasma) من الأشجار المصابة، يتم الاستنساخ في نواقل الطعم واختباره من حيث التنشيط الذاتي والتعبير وفقاً للبروتوكول النصي.

قم بتخطيط السلالة A ATP 00189 effector المحولة NMY51 على طبق SD-trp جديد، وزرعها عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى تظهر مستعمرات حمراء. استخدم مستعمرة حمراء من طبق الآجار لتلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط SD-trp في دورق هزاز صغير، وحضن المزرعة طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج بسرعة 120-150 دورة في الدقيقة. وفي اليوم التالي، استخدم ملليلتر واحد من المزرعة الليلية لتلقيح 20 ملليلتر من SD-trp في دورق هزاز، واتركها تنمو لمدة ثماني ساعات.

استخدم وسط SD-trp لضبط المزرعة حتى تصل قيمة OD600 إلى 0.2، وباستخدام عشرة مليلترات من المزرعة، قم بتلقيح قارورتين تحتوي كل منهما على 100 مليلتر من وسط SD-trp. حضّن المزارع عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج طوال الليل. بعد ذلك، قم بقياس OD600 للمزرعة وقم بترسيب 120 وحدة OD600.

على سبيل المثال، إذا تم قياس OD600 بقيمة 1.2، يتم تدوير 100 milliliters من العينة، والتخلص من الطافي، واستخدام 800 milliliters من 2xYPAD المسخن مسبقاً لإعادة تعليق الراسب في قارورتي هزازتين والتحضين عند 30 degrees Celsius. يتم تحضين مزرعة الخميرة عند 30 degrees Celsius وبسرعة 120-150 rotations per minute. يتم قياس OD600 كل 1.5 hours تقريباً وفقاً للبروتوكول المكتوب حتى الوصول إلى OD600 بقيمة 0.6.

بعد تحضير DNA من نطاف السلمون وTe Lithium OAc وPEG Lithium OAc وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم طرد مركزي لـ 800 milliliters من مستنبت الخميرة عند 700 x G لمدة خمس دقائق لترسيب الخلايا. يتم إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الرواسب في إجمالي 200 milliliters من الماء المقطر المزدوج المعقم. ثم يتم ترسيب الخلايا مرة أخرى والتخلص من السائل الطافي.

أعد تعليق الراسب في 16 milliliters من مزيج Te Lithium OAc وقم بتدوير العينة مرة أخرى. ثم بعد التخلص من السائل الطافي، استخدم 9.6 milliliters من Te Lithium OAc لإعادة تعليق الراسب. وفي أوعية تفاعل ذات حجم مناسب، قم بتجهيز اثني عشر أنبوباً تحتوي كل منها على سبعة micrograms من ناقل مكتبة HAC DNA من peak، و100 microliters من 2% salmon sperm DNA، و2.5 milliliters من مزيج PEG Lithium OAc.

أضف 600 µL من معلق خلايا الخميرة الذي تم تحضيره مسبقًا إلى كل من القوارير الاثنتي عشرة، وامزج المزيج بقوة لمدة دقيقة واحدة. ثم حضن التفاعلات في حمام مائي عند 30 °C لمدة 45 دقيقة مع التقليب كل 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف 160 µL من DMSO إلى كل قارورة وامزج بقوة.

بعد ذلك، يتم تحضين القوارير عند درجة حرارة 42 °C لمدة 20 دقيقة إضافية. وبعد تجميع الخلايا في شكل رواسب، تخلص من السائل الطافي واستخدم 3 mL من 2xYPAD لإعادة تعليق كل راسب. اجمع الخلايا من جميع القوارير الاثني عشر في قارورة هزازة سعة 100 mL، ثم حضن الخميرة لمدة 90 دقيقة عند درجة حرارة 30 °C وبسرعة 120 دورة في الدقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، وعقب تجميع الخلايا في شكل كريّة والتخلص من السائل الطافي، استخدم ماصة سيرولوجية سعة عشرة ملليلتر و 4.5 milliliters من كلوريد الصوديوم المعقم بتركيز 0.9% لإعادة تعليق الكريّة بشكل كامل عن طريق السحب والدفع بالماصة بعناية. اسحب 50 µL من المعلق واستخدم كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9% لتحضير تخفيفات عشرية تتراوح من 1:10 وصولاً إلى 1:1000. ثم قم بنشر 100 µL من كل تخفيف على أطباق بتري بقطر 90 millimeter تحتوي على آغار SD-trp-leu.

قم بنشر ما تبقى من معلق الخميرة غير المخفف على 16 طبق بتري بقطر 150 مليمتر تحتوي على آغار SD-trp-leu-His-ade. قم بتحضين الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام للأطباق التي تحتوي على SD-trp-leu ولمدة أربعة أيام للأطباق التي تحتوي على SD-trp-leu-his-ade. حدد كفاءة عفن التحول (transfection efficiency) عن طريق عد المستعمرات الناتجة عن التخفيفات المتسلسلة المختلفة على أطباق الاختيار SD-trp-leu.

انقل كل مستعمرة باستخدام رأس ماصة معقم لالتقاط وتخطيط المستعمرة على أطباق اختيارية طازجة من نوع SD-trp-leu-his-ade. حضّن الأطباق عند 30 degrees Celsius لمدة 24 ساعة. كرر عملية نقل المستعمرات يومياً حتى يتم إتمام خمس ممرات إجمالاً.

لتحليل المستنسخات، وفي ظل ظروف تعقيم داخل كبينة التدفق الصفائحي، قم بتحضير أنبوب تفاعل معقم سعة 2 mL يحتوي على 1 mL من وسط SD-trp-leu-his-ade لكل مستنسخ. استخدم إبرة ساخنة لثقب كل أنبوب، ثم استخدم سدادة نفاذة للغازات لتغطية الثقب. قم بتلقيح كل أنبوب بمادة مستعمرة حديثة من مستنسخ واحد، ثم حضن الأنابيب عند درجة حرارة 30 °C وبسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.

بعد تجميع الخلايا في كريس والـتخلص من السائل الطافي، أعد تعليق الراسب في المنظم المناسب وانقله إلى أنبوب تفاعل جديد سعة 2 mL. أضف 100 µL من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض إلى المعلق ورج الأنبوب بقوة لمدة خمس دقائق. وأخيراً، قم بتنقية DNA البلازميد وفقاً للبروتوكول المكتوب.

يوفر هذا الجدول والشكل ملخصًا للنتائج المتوقعة لمقايسة التنشيط الذاتي وتفسيرها. يؤدي التنشيط الذاتي الضعيف إلى النمو على أطباق الاختيار المستنفدة من trp-leu-his، ولكن ليس على الأطباق المستنفدة من trp-leu-his-ade. بينما تنمو الخميرة المحولة بطعم قوي التنشيط الذاتي على الوسط الخالي من trp-leu-his-ade.

تتميز عملية التحويل المشترك الناجحة للبروتين الطُعم والبروتين الفريسة بالنمو على أطباق انتقائية تفتقر إلى trp و leu. ويؤدي التفاعل بين بروتين الطُعم وبروتين الفريسة إلى تعويض نقص oxytrophy لكل من his و ade في سلالة NMY51. يظهر هنا مثال على التفاعل بين الطُعم والفريسة في تجربة Yeast 2 Hybrid. حيث تم تحديد شركاء التفاعل المضيف في Malus domestica وهم MdTCP24 و MdTCP25، وتم تأكيد التفاعل عن طريق تحويل المخروط de novo باستخدام المؤثر.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذ اختبار الهجين الثنائي للخميرة في يوم واحد إذا تم تحضير جميع المعدات والمواد اللازمة مسبقاً وبشكل صحيح، وخاصة الخميرة. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تجنب التلوث والعمل دائماً تحت ظروف معقمة. وبعد تنفيذ هذا الإجراء، يجب تطبيق طريقة مستقلة أخرى، مثل تكامل الفلورة ثنائي الجزيئات على سبيل المثال، لتأكيد تفاعلات البروتين-بروتين التي تم اكتشافها.

يكتسي هذا الأمر أهمية خاصة نظراً لأن الخميرة أو الهجين بحد ذاته عرضة نسبياً لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في العديد من المجالات البحثية المختلفة لفهم المبادئ الجزيئية التي تنطوي عليها التفاعلات بين البروتينات بشكل أفضل، لا سيما في التفاعلات بين المضيف والممرض، والعديد من المجالات البحثية البيولوجية الأخرى. علاوة على ذلك، ستدرك أن تنفيذ هذه الطريقة ممكن بسهولة في أي مختبر بيولوجيا جزيئية مجهز بشكل جيد.

تذكر أن العمل مع بعض المواد الكيميائية، والمشارط، واللهب المكشوف قد يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب عليك دائمًا اتخاذ احتياطات معينة عند تنفيذ هذا الإجراء. وهذا يعني استخدام معدات السلامة الشخصية مثل القفازات والنظارات الواقية، واستخدام معدات السلامة العامة في المختبر.