Name: توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: اكتشف طريقة توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ. يوضح هذا البروتوكول خطوات موثوقة لتحضير مركبات البورون وتطبيقاتها في البحوث الطبية الحيوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS (R01-GM094541) وكلية بوسطن.

<ol><li>Ducruix, A., Giége, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDucruix%2C+A+%22Crystallization+of+Nucleic+Acids+and+Proteins%2C+A+Practical+Approach%22">Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).</li>
<li>Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v08-110#.WLBilzsrLIU">B-N as a C-C substitute in aromatic systems.</a> Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).</li>
<li>Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22644658">Recent Advances in Azaborine Chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).</li>
<li>Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25469827">Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties.</a> Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).</li>
<li>Zhou, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+isomerism%3A+a+boron-nitrogen+surrogate+for+a+carbon-carbon+double+bond+increases+the+chemical+diversity+of+estrogen+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands.</a> Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).</li>
<li>Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization%2C+and+binding+property+of+isoelectronic+analogues+of+nucleobases%2C+B%286%29-substituted+5-aza-6-borauracils+and+-thymines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines.</a> Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).</li>
<li>Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BN%2FCC+isosterism+in+borazaronaphthalenes+towards+phosphodiesterase+10A+%28PDE10A%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).</li>
<li>Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzazaborinines+as+Novel+Bioisosteric+Replacements+of+Naphthalene%3A+Propranolol+as+an+Example%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example.</a> J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).</li>
<li>Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01060a034">New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).</li>
<li>White, D. G. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00905a022">2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes.</a> J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).</li>
<li>Ashe III, A. J., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Synthesis+of+Aromatic+Five-+and+Six-Membered+B%E2%88%92N+Heterocycles+via+Ring+Closing+Metathesis%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis.</a> Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).</li>
<li>Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hybrid+Organic%2FInorganic+Benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Hybrid Organic/Inorganic Benzene.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).</li>
<li>Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+Group-Free+Synthesis+of+1%2C2-Azaborines%3A+A+Simple+Approach+to+the+Construction+of+BN-Benzenoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).</li>
<li>Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodium-catalyzed+boron+arylation+of+1%2C2-azaborines%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).</li>
<li>Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negishi+Cross-Coupling+Is+Compatible+with+a+Reactive+B-Cl+Bond%3A+Development+of+a+Versatile+Late-Stage+Functionalization+of+1%2C2-Azaborines+and+Its+Application+to+the+Synthesis+of+New+BN+Isosteres+of+Naphthalene+and+Indenyl%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl.</a> J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).</li>
<li>Knack, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23355270">BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).</li>
<li>Eriksson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+a+Protein+Structure+to+Cavity-Creating+Mutations+and+Its+Relation+to+the+Hydrophobic+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect.</a> Science. 255 (5041), 178-183 (1992).</li>
<li>Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cavity-containing+mutant+of+T4+lysozyme+is+stabilized+by+buried+benzene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene.</a> Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).</li>
<li>Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+Origins+of+Specificity+of+Ligand+Binding+in+an+Interior+Nonpolar+Cavity+of+T4+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme.</a> Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).</li>
<li>Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+Binding+Site+for+Testing+Scoring+Functions+in+Molecular+Docking%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking.</a> J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).</li>
<li>Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Bonding+of+1%2C2-Azaborines+in+the+Binding+Cavity+of+T4+Lysozyme+Mutants%3A+Structures+and+Thermodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics.</a> J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).</li>
<li>Brown, H. C., Racherla, U. S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280707532_Organoboranes_43_A_convenient_highly_efficient_synthesis_of_triorganylboranes_via_a_modified_organometallic_route">Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route.</a> J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halogenated+Benzenes+Bound+within+a+Non-polar+Cavity+in+T4+Lysozyme+Provide+Examples+of+I.S+and+I.Se+Halogen-bonding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding.</a> J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).</li>
</ol>

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة في هذه المخطوطة.

في الجزء الأول من هذا البروتوكول، وصفنا توليفة معدلة من 1،2-azaborines على أساس أساليب ذكرت سابقا 12 و 13. وقد استخدم Triallylborane 22 كبديل للطرق باستخدام allyltriphenyl القصدير أو البوتاسيوم allyltrifluoroborate لإعداد N -allyl- N -TBS- ب -allyl ناتج إضافة كلوريد (1). وتسمح هذه الطريقة لاتباع نهج أكثر ذرة اقتصادية وصديقة للبيئة. لتركيب N -TBS- ...

وضعت البورون النيتروجين التي تحتوي على حلقات غير متجانسة (أي 1،2-azaborines) في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا كما isosteres من أرينية. هذا isosterism يمكن أن يؤدي إلى تنويع الأشكال الهيكلية القائمة لتوسيع مساحة الكيميائية 2، 3، 4. Azaborines لها فائدة محتملة لتطبيقها في البحوث الطبية الحيوية 5، 6، 7، 8، خصوصا في مجال الكيمياء الطبية التي الكيميائيين إجراء توليف مكتبات هيكليا والجزيئات ذات الصلة وظيفيا. إلى حد كبير، ومع ذلك، في حين أن هناك العديد من طرق اصطناعية متطورة إلى الجزيئات التي تحتوي على دآرين المتاحة، تم الإبلاغ سوى عدد محدود من الطرق لتركيب azaborines 9، 10، </sتصل&gt; 11، 12، 13. ويرجع ذلك أساسا إلى عدد محدود من الخيارات لمصدر البورون والجوي وطبيعة رطوبة الحساسة من جزيء في مرحلة مبكرة من تسلسل الاصطناعية. في الجزء الأول من هذه المقالة، فإننا سوف تصف توليفة نطاق متعدد غرام من N -TBS- ب -Cl-1،2-azaborine (3) باستخدام تقنيات خالية من الهواء القياسية. يخدم هذا المركب كمادة وسيطة تنوعا التي يمكن زيادة functionalized لهيكليا أكثر تعقيدا الجزيئات 14 و 15. بدءا من 3، وسيتم وصف التوليف وتنقية N -H- ب -ethyl-1،2-azaborine (5) لاستخدامها في دراسات ملزمة البروتين. نظرا لتقلب 5، عزلتها فعالة تتطلب مراقبة دقيقة من درجة حرارة التفاعل، والوقت، وشعبة نظماستنتاج الظروف. في الجزء الثاني، وبروتوكولات للتعبير البروتين وعزل المسوخ T4 الليزوزيم (L99A وL99A / M102Q) 17، 18، 19، وستقدم 20، تليها بلورة البروتين وإعداد المجمعات الكريستال البروتين يجند. وقد تم اختيار المسوخ T4 الليزوزيم L99A وL99A / M102Q كما نظم نموذج البيولوجية لدراسة قدرة الرابطة الهيدروجينية من NH تحتوي على جزيئات azaborine 17. استخدام معيار بروتوكول البيولوجيا الجزيئية، ويتم التعبير عن هذا البروتين في سلالة كولاي RR1 والتي يسببها مع الآيزوبروبيل-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ويتم تنقية البروتين خارج باستخدام التبادل الأيوني العمود اللوني. يتم تنفيذ البروتين تبلور مع الحل عالية التركيز النقي البروتين (&gt; 95٪ نقاء من قبل الكهربائي للهلام) باستخدام شنقاإسقاط طريقة نشر بخار. ونظرا لحساسية بروابط هذه الدراسة إلى الأكسجين، يتم إعداد المجمعات البروتين يجند في ظل ظروف خالية من الهواء.

<table><tbody><tr><td>رباعي هيدروفوران (THF) ، خالي من المثبطات ، ل HPLC ، & ge ؛ 99.9٪</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>34865</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي إيثيل الأثير (Et2O) ، ل HPLC ، & ge ؛ 99.9٪ ، خال من مثبطات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الميثيلين &nbsp ؛ (CH2Cl2) ، (ACS مستقر / معتمد)</td> <td>فيشر</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>تولوين</td><td>فيشر</td><td>T290-4</td><td></td></tr><tr><td>بنتان ، HPLC</td><td>فيشر</td><td>P399-4</td><td></td></tr><tr><td>أسيتونيتريل</td><td>فيشر</td><td>A21-4</td><td></td></tr><tr><td>هيدريد الكالسيوم (CaH2) ، درجة الكاشف ، 95٪</td> <td>سيجما</td><td>ألدريتش 208027</td><td>البلاديوم الحمايي</td></tr><tr><td>على الكربون المنشط (Pd / C) ، 10٪ بالوزن Pd</td><td>Strem</td><td>46-1900</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M محلول ثلاثي كلوريد البورون في الهكسان</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>211249</td> ثلاثي إيثيل أمين <td>شديد السمية / البيروفوريك</td></tr><tr><td>، & ge ؛ 99.5٪</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>Grubbs 1st جيل catalyst&nbsp;</td><td>المواد</td><td>C823</td><td></td></tr><tr><td>أسيتاميد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A0500</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol ، لامائي ، 99.8٪</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>281549</td><td></td></tr><tr><td>محلول إيثيل ليثيوم ، 0.5 & nbsp ؛ M في البنزين / الهكسان الحلقي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>561452</td> محلول حمض الهيدروكلوريك <td>شديد السمية / البيروفوريك</td></tr><tr><td>، 2.0 متر في Et2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>455180</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane ، اللامائي ، & ge ؛ 99٪</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td> الإشريكية القولونية ، (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC &reg ؛ 31343 &trade;)</td><td>ATCC</td><td>31343</td><td></td></tr><tr><td>T4 lysozyme WT * (L99A) Addgene</td><td></td> <td>18476</td><td></td></tr><tr><td>T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D)</td> <td>Addgene</td><td>18477</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم أمبيسلين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>الأيزوبروبيل-&بيتا;-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة اللامائي</td><td>فيشر</td><td>BP329</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي</td><td>فيشر</td><td>BP332</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر</td><td>S642212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>فيشر</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد المغنيسيوم</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>M4880</td><td></td></tr> ثقب <tr><td>علمي حراري تآكل DNaseI</td><td>فيشر</td><td>PI-90083</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare &nbsp; Sepharose تدفق سريع كاتيون تبادل وسائل الإعلام</td><td>فيشر</td><td>45-002-931</td><td></td></tr><tr><td>تريس قاعدة</td><td>فيشر</td><td>BP152-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>TCI</td><td>S0489</td><td>شديد السمية</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>ICN806443&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sartorius&nbsp; Vivaspin 20 مكثفات الطرد المركزي</td><td>فيشر</td><td>14-558-501</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>2-هيدروكسي إيثيل ثاني كبريتيد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>380474</td><td></td></tr><tr><td>N-paratone&nbsp;</td><td>هامبتون للأبحاث</td><td>HR2-643</td><td></td></tr><tr><td>4 RC أنابيب غشاء غسيل الكلى 12,000 إلى 14,000 دالتون MWCO &nbsp ؛</td><td>فيشر</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; أنابيب مبردة من CryoLoop</td><td>Hampton Research</td><td></td><td>على شكل حلقة</td></tr> يتم <tr><td></td><td>إنشاء صور كثافة الإلكترون</td> المبردة <td></td><td></td></tr><tr><td>CryoTong</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr> من البرنامج</tbody></table>

توليف 1،2-azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع t4 الليزوزيم المسوخ

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

نصف توليفا عاما ل 1،2-azaborines باستخدام تقنيات قياسية خالية من الهواء وتحضير مركب البروتين مع طفرات الليزوزيم T4 عن طريق انتشار البخار. يتم تحضير المركبات الحساسة للأكسجين والرطوبة وعزلها تحت جو خامل (N2) باستخدام مشعب غاز مفرغ أو صندوق قفازات. كمثال على تخليق الآزابورين ، نوضح تخليق وتنقية N-H-B-ethyl-1،2-azaborine المتطاير من خلال تسلسل من خمس خطوات يتضمن التقطير وكروماتوغرافيا العمود لعزل المنتجات. يتم التعبير عن طفرات الليزوزيم T4 L99A و L99A / M102Q بسلالة الإشريكية القولونية RR1. توفر البروتوكولات القياسية لتحلل الخلايا الكيميائية متبوعا بالتنقية باستخدام عمود التبادل الأيوني للكربوكسي ميثيل بروتينا عالي النقاء بدرجة كافية للتبلور. يتم إجراء تبلور البروتين بتركيزات مختلفة من الترسيب في نطاقات مختلفة من الأس الهيدروجيني باستخدام طريقة انتشار بخار القطرة المعلقة. يتم التحضير المعقد مع الجزيئات الصغيرة بطريقة نشر البخار تحت جو خامل. يوفر تحليل حيود الأشعة السينية للمركب البلوري دليلا هيكليا لا لبس فيه على تفاعلات الربط بين موقع ربط البروتين و 1،2-azaborines.

ويظهر الطريق الاصطناعية التخطيطي ل1،2-azaborines في الشكل 1. ينطبق هذا البروتوكول لتخليق خمسة مختلفة البورون النيتروجين التي تحتوي على جزيئات. يمثل الرقم 2 11 ب NMR الأطياف قياسها أثناء الخطوة 1.3 لمراقبة تشكيل المنتج المطلوب (3). تم إجراء تنقية البروتين باستخدام نظام اللوني الضغط المنخفض وأظهرت اللوني تمثيلي في الشكل (3). تم تحديد نقاء من الكسور التي تم جمعها من قبل SDS...

يتم تقديم بروتوكول لتخليق 1،2-azaborines وإعداد مجمعات البروتين الخاصة بهم مع طفرات الليزوزيم T4.

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف طريقة عامة لتخليق 1, 2-Azaborines، وتطبيقاتها المحتملة في الأبحاث الطبية الحيوية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تضمن تخليق مركبات 1, 2-azaborine، والتي تُعد نظائر هيكلية (isosteres) مدمجة تحتوي على البورون لنمط البنزين واسع الانتشار. ويمكن إجراء مزيد من الوظيفية للمادة السليفة الموصوفة لتحويلها إلى جزيئات قد تكون أكثر تعقيداً.سيوفر تحضير المعقدات البروتينية مع 1, 2-azaborine بعض الرؤى حول التطبيقات المستقبلية في الأبحاث الطبية الحيوية. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير المنتج مغلق الحلقة كما هو موضح في البروتوكول النصي. أضف 14 grams من palladium on carbon إلى هذا المنتج المُحضّر في toluene.بعد ذلك، أخرج القارورة من الصندوق. قم بتركيب مكثف ارتجاعي 24/40 مجفف في الفرن، ومنقى بالنيتروجين، ومزود بماء مبرد، على القارورة. ضع القارورة في حمام زيتي، وسخن التفاعل حتى يصل إلى حالة الارتجاع القوي عند 135 °C مع التقليب.حافظ على التفاعل في حالة الارتداد لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، أخرج الدورق من الحمام الزيتي لتبريد التفاعل حتى درجة حرارة الغرفة. وبمجرد تبريده، استبدل مكثف الارتداد بالسدادة المطاطية (septum) على دورق التفاعل.باستخدام حقنة مجهزة بإبرة Luer Lock مجففة في الفرن، اسحب جزءًا حجمه 5 milliliter. انقل هذا الجزء إلى أنبوب NMR ذي غطاء لولبي. حلل العينة عن طريق Boron-11 NMR.إذا كان التفاعل غير مكتمل، انقل دورق التفاعل إلى صندوق القفازات. بعد ذلك، أضف ثلاثة جرامات إضافية من Palladium on carbon. ثم، أخرج الدورق من صندوق القفازات.ثبّت في الدورق مكثف ارتجاعي 24/40 تم تطهيره بالنيتروجين وتزويده بالماء المبرد. وباستخدام حمام زيتي، سخّن التفاعل حتى يصل إلى الارتجاع القوي عند 135 degrees celsius مع التقليب لمدة 24 ساعة. وباستخدام الرنين المغناطيسي النووي لـ Boron-11، حلل عينة أخرى للتأكد من اكتمال التفاعل.بعد ذلك، انقل دورق التفاعل مرة أخرى إلى صندوق القفازات. قم بتمرير خليط التفاعل عبر عمود كروماتوغرافيا وميضية محشو بمناديل ورقية. ثم اجمع الراشح في دورق مستدير القاع سعة لتر واحد ومزود بقضيب تحريك.اغسل العمود باستخدام 50 milliliters من التولوين. أخرج وعاء الراشح من الصندوق القفازي وقم بتوصيله بمشعب غاز مفرغ مجهز بخط نيتروجين. ضع حماماً مائياً أسفل القارورة، ودواراً يحتوي على نيتروجين سائل لاحتجاز المذيب.افتح صمام الفراغ العالي لبدء إزالة جميع المواد المتطايرة من الرشاحة. بعد ذلك، أعد خليط التفاعل إلى صندوق القفازات. انقل الخليط إلى دورق مستدير القاع سعة 250 milliliter من القياس 24/40 جرى تجفيفه في الفرن ويحتوي على قضيب تحريك.اشطف خليط التفاعل المتبقي باستخدام dichloromethane، وانقله إلى الدورق. أغلق فوهة الدورق باستخدام سدادة (septum). انقل الدورق من صندوق القفازات إلى المانيفولد المفرغ من الهواء، وقم بتوصيله.افتح صمام الفراغ العالي لإزالة المذيب المتبقي. بعد ذلك، قم بإزالة السدادة المطاطية سريعاً وأضف هيدريد الكالسيوم باستخدام الملعقة المختبرية. قم بتوصيل الدورق مستدير القاعدة بجهاز التقطير الموضح في البروتوكول النصي، واضبط درجة حرارة الحمام الزيتي على 100 °C.بعد اكتمال عملية التقطير، قم بإزالة مصدر الحرارة وتبريد الجهاز حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أعد ضغط الجهاز المبرد باستخدام النيتروجين، وأغلق صمام السدادة في قارورة التخزين الخالية من الهواء بإحكام. بعد نقل المنتج المعزول من القارورة إلى قارورة صغيرة (vial) داخل صندوق القفازات، قم بتخزين القارورة في مجمّد صندوق القفازات.بعد تنقية البروتين، انقل المحلول المنقى إلى أنابيب غشاء الديلزة. ضع أنابيب الديلزة في وعاء يحتوي على محلول سعة أربعة لترات من 100 millimolar sodium phosphate و 550 millimolar sodium chloride و 02% sodium azide. قم بالتقليب طوال الليل عند درجة حرارة four degrees celsius.في اليوم التالي، أضف 2-mercaptoethanol إلى العينة التي خضعت للديلزة، بحيث يكون التركيز النهائي 5 millimolar. بعد ذلك، استخدم مُركّزاً طردياً لتركيز المحلول إلى 40 mg/mL. قم بتدوير العينة بسرعة 5,000 RPM وعند درجة حرارة 6 °C، ثم قم بإزالة أي راسب بعد عملية التركيز.بعد ذلك، في طبق مكون من 24 بئراً، قم بإعداد الظروف المختلفة باستخدام محلول الخزان، كما هو موضح في البروتوكول النصي. استخدم الشحم لضمان الإغلاق المحكم عن طريق وضعه على حافة كل بئر. اخلط 5 µL من محلول البروتين المركز مع 5 µL من محلول الخزان على شريحة غطاء زجاجية مـسيلكونة.ضع شريحة الغطاء مقلوبة فوق الآبار التي تحتوي على محلول الخزان. احفظ الصفيحة عند درجة حرارة 4 degrees celsius لنمو البلورات. باستخدام حلقة من أنابيب التجميد، التقط البلورات النامية وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 6 milliliter.أضف 50 µL من السائل الأم. بعد ذلك، انقل الأنبوب إلى صندوق القفازات. انقل 5 µL من ربيطة الآزابورين (azaborine ligand) المحضرة إلى الجزء الداخلي من غطاء الأنبوب القابل للإغلاق.أغلق الأنبوب بإحكام، واحفظه في ثلاجة داخل صندوق القفازات لمدة تتراوح بين يومين إلى سبعة أيام لتحقيق التوازن عن طريق الانتشار البخاري. بعد ذلك، ضع قطرة من N Paratone على شريحة زجاجية. وباستخدام ماصة دقيقة، انقل البلورة إلى الشريحة.بعد ذلك، استخدم حلقة من الأنابيب المبردة لالتقاط البلورة ونقلها من المحلول المائي إلى زيت N Paratone. اغمر البلورة المحمية بزيت N Paratone في وعاء ديوار يحتوي على نيتروجين سائل. وباستخدام ملاقط تبريد، قم بتثبيت البلورة المجمدة سريعاً على الحلقة.بعد ذلك، قم بتحليل بيانات البلورات التي تم جمعها كما هو موضح في البروتوكول النصي. يتم تقديم تخليق معدل لمركبات 1, 2-azaborines في هذه الدراسة بناءً على طرق تم الإبلاغ عنها سابقاً. يُستخدم Tri-allele borine لتحضير N-allele NTBSB-allele chloride adduct.يتم استخدام تسلسل من خطوتين في عملية واحدة لتخليق NTBS BCl 1، وهو 2-azaborine، مما يؤدي إلى الحصول على عائد استخلاص أعلى مقارنة بالطرق السابقة. يتم إتمام تخليق N-H-B-ethyl-1, 2-azaborine في خطوتين، باستخدام ethyllithium بدلاً من معقد الكروم المستخدم في الطرق المبلغ عنها سابقاً. ويتم تنقية البروتين باستخدام نظام كروماتوغرافيا منخفض الضغط.يُظهر مخطط الكروماتوغرام الذي تم تشغيله عند 280 نانومتر قمة تتفق مع طفرة T4 Lysozyme، L99am102q. بعد ذلك يتم بلورة البروتين وتكوين معقدات معه باستخدام الربيطات. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن تخليق azaborine يتطلب استخدام ظروف خالية من الهواء، مثل صندوق القفازات ومنشأة غاز مفرغة، لمنع تحلل المركبات.بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف الخصائص الكيميائية والفيزيائية الفريدة للأزابورينات مقارنة بالمركبات العطرية الكربونية في جيوب الاستصلاح المناطقية البيولوجية الكلاسيكية.

synthesis-12-azaborines-preparation-their-protein-complexes-with-t4

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

صممت جزيئات الفيروس الغدي لاحتواء إما غير طبيعي التماثلية الأحماض الأمينية azidohomoalanine أو السكر...

Chemoselective تعديل السطوح الفيروسية عن طريق الكيمياء نقرة Bioorthogonal

يوصف N-TS-iodoaziridines - بروتوكول لdiastereoselective إعداد وعاء واحد من رابطة الدول المستقلة. توليد diiodomethyllithium، بالإضافة إلى N-TS aldimines وسيكليزيشن من ويتجلى الأمينية ثنائي يوديد جوهرة المتوسط ​​إلى iodoaziridines. وشملت أيضا هو بروتوكول بسرعة وكميا لتقييم مرحلة ثابتة الأنسب لتنقية بواسطة اللوني.

التوليف وتنقية Iodoaziridines إشراك الكمي التحديد الأمثل للقرطاسية المرحلة اللوني لل

هنا ، نقدم بروتوكولا لإدخال مجسات كيميائية على وجه التحديد في موقع في جزء من الجسم المضاد عن طريق دمج حمض أميني يحتوي على أزيد وراثيا ، وبالتالي اقتران الأزيد بمسبار كيميائي عن طريق إضافة أزيد الألكين الحلقية المعززة بالسلالة (SPAAC).

كفاءة والخاصة بالموقع الأجسام المضادة وصفها من قبل Cycloaddition-أزيد آلكاين-روجت سلالة

تم توليد أيونات تربين أزيريدينيوم مثل توسيلاتي هيبتان 1-أزونيابيسيكلو [4.1.0] من 2-[4-تولينيسولفونيلوكسيبوتيل] أزيريديني، التي كانت تستخدم لإعداد بيبيريدينيس المستبدلة وأزيبانيس عبر ريدجو وستيريوسبيسيفيك توسيع حلقة مع نوكليوفيليس مختلفة. هذا البروتوكول ذات كفاءة عالية سمح لنا بإعداد أزاهيتيروسيكليس متنوعة بما في ذلك المنتجات الطبيعية مثل فاجوميني والتماثلية فيبريفوجيني وبالانول.

إعداد أيونات أزيريدينيوم تربين مستقرة وعلى فتح الحلقة لتوليف أزاهيتيروسيكليس

3-كارريل-ن-هيدروكسي-5-نيتروندينوليس تم توليفها بالاضافه الحلقية من 4-نيترونيتروسوبينزيني مع الجهاز الطرفي المترافق الالكيوني في اجراء الحرارية خطوه واحده. وقد تم الإبلاغ بشكل كاف عن اعداد نيتروروارين ومن الكينينات ، وعلي التوالي من خلال إجراءات الاكسده علي الانيلين المقابلة وعلي الكينول.

التوليف المباشر والانتقائي والاقتصادي للذرة من 3-Aroyl-N-هيدروكسي-5-نيتروندينوليس بالاضافه الحلقية من 4-نيترونيتروسوبينزيني مع الكينونات

في هذه الدراسة ، نقوم بإعداد كل من enantiomers من aziridine-2-carboxylate ، والتي تستخدم في التوليف غير المتماثل للقلويدات ، بما في ذلك biemamide B و D ، و (-)-epiallo-isomuscarine.

تحضير الأزيريدين غير المنشط Enantiopure وتخليق البيماميد B و D و epiallo-isomuscarine

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء وضع العلامات على البروتين الخاص بنوع الخلية باستخدام أزيدونونورليوسين (ANL) باستخدام خط ماوس يعبر عن سينثيتاز L274G-Methionine tRNA المتحور (MetRS *) والخطوات اللازمة لعزل البروتينات الخاصة بنوع الخلية الموصوفة. نحدد طريقين محتملين لإدارة ANL في الفئران الحية عن طريق (1) مياه الشرب و (2) الحقن داخل الصفاق.

تنقية البروتين المحدد من نوع الخلية والتعرف عليه من الأنسجة المعقدة باستخدام خط ماوس الميثيونين tRNA Synthetase الطافر

تم تصنيع البيسازيريدين المتجاورة التي تحتوي على أزيريدينات غير نشطة ومنشطة بواسطة أزيريدينات محفزة عضوية غير متماثلة ثم تعرضت لتفاعلات فتح حلقة كيميائية انتقائية في ظل ظروف حمضية أو أساسية. تفتح حلقة الأزيريدين غير المنشطة مع نيوكليوفيلات أقل تفاعلا في ظل الظروف الحمضية ، في حين تفتح حلقة الأزيريدين المنشطة مع نيوكليوفيلات أكثر تفاعلا في ظل الظروف الأساسية.

تحضير البيسازيريدين المتجاورين لتفاعلات فتح الحلقة الانتقائية

يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج وتقييم النشاط المضاد للميكروبات وسمية الخلايا للببتيد الكاتيوني Mel4 والمقلد الببتيد RK758. من خلال دمج التخليق الكيميائي، والتعبير المؤتلف، والاختبارات الوظيفية الموحدة، يوفر ذلك سير عمل مبسط لإنتاج واختبار الببتيدات ومحاكاة الجزيئات الصغيرة.

إنتاج واختبار الببتيدات المضادة للميكروبات ومحاكاتها

نصف إجراءات تحضير وتسليم البلورات الدقيقة للبروتين الغشائي في الطور المكعب الدهني لعلم البلورات التسلسلي في ليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية ومصادر السنكروترون. يمكن أيضا تطبيق هذه البروتوكولات لدمج وتسليم بلورات البروتين الدقيقة القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في استهلاك العينة مقارنة بالحقن السائل.

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

اكتشف طريقة توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ. يوضح هذا البروتوكول خطوات موثوقة لتحضير مركبات البورون وتطبيقاتها في البحوث الطبية الحيوية.

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

استكشف المزيد من الفيديوهات