يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أزهار نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا لتصوير براعم الزهور الحية النامية باستخدام مجهر متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال نمو الأزهار حول تكوين أعضاء الزهرة ووضعها وديناميكيات الخلايا الجذعية للزهرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصوير الحي للزهور أثناء تشكلها وهو أمر بالغ الأهمية لفهم ما هو في جوهره عملية ديناميكية.

لفضح براعم الزهور للتصوير ، استخدم الملقط لإزالة النورات الثانوية وبراعم الزهور القديمة من الإزهار الأولي. بعد ذلك ، استخدم الملقط لاختراق ثقب عمودي في الاغاروز في طبق تشريح. الآن قم بقطع آخر 0.5 سم من الإزهار وتثبيته في وضع مستقيم في الاغاروز مع براعم الزهور المتبقية فوق سطح الاغاروز.

املأ الطبق بالماء المعقم منزوع الأيونات بحيث يتم غمر قمة اللقطة بالكامل واستخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لطرد أي هواء محاصر حول قمة التصوير. ثم ضع العينة تحت مجهر استريو. استخدم الملقط لإزالة براعم الزهور التي لا يجب تصويرها من العينة المغمورة.

عند الوصول إلى المرحلة السابعة من براعم الزهور ، قم بإزالة الماء من طبق التشريح ، واستبدل طبق التشريح تحت المجهر وقم بإنهاء التشريح. يمكن بعد ذلك وضع القمة في وضع مستقيم في وسط طبق التصوير بحيث تكون النسيج الإنشائي القمي فقط وبراعم الزهور المحيطة فوق سطح الوسط. إذا لم يتم تلطيخ القمة على الفور ، فاستخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لإضافة قطرة ماء إلى العينة للحفاظ على رطوبتها.

لتلطيخ براعم الزهور ، قم أولا بإزالة الماء من سطح طبق التصوير بقطعة من المناديل الورقية. ثم ضع الطبق على جانبه لتصريف أي ماء متبقي من السطح المتوسط. انتظر دقيقة ثم قم بإزالة الماء المجمعة بمنديل جديد.

ثم تحت المجهر ، استخدم ماصة سعة 10 ميكرولتر لتطبيق 20 إلى 30 ميكرولتر من البقعة المناسبة ، مع الحرص على تغطية العينة بأكملها لضمان تلطيخ متجانس. بعد فترة الحضانة المناسبة ، اشطف البراعم مرتين بالماء المعقم منزوع الأيونات. للتصوير على المجهر المقلوب، استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لوضع قطرة من الماء المعقم منزوع الأيونات على طرف العدسة.

ثم اقلب طبق التصوير رأسا على عقب ، وأضف قطرة من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى قمة التشريح وضع العينة رأسا على عقب على مرحلة المجهر ، مع الحرص على عدم سحق العينة. استخدم وحدات التحكم X و Y و Z لوضع القمة المقطوعة على اتصال بالقطرة الموجودة في طرف العدسة. سوف يتشكل عمود الماء.

للتصوير على المجهر العمودي ، املأ طبق التصوير بالماء المعقم منزوع الأيونات بحيث يتم غمر سطح الوسط والعينات بالكامل في 2.5 إلى خمسة ملليمترات من الماء. بعد ذلك ، ضع الطبق على مرحلة المجهر المستقيم واضبط عدسة غمس الماء في المسرح بحيث ينخفض طرف العدسة في الماء. ثم استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لطرد أي فقاعة هواء محاصرة في طرف العدسة.

بالنسبة لأي نوع من المجهر، عندما تكون العينة جاهزة، استخدم وحدة التحكم X وY لوضع إحدى القمم التي تم تشريحها داخل مجال العدسة ووحدة التحكم Z للتركيز على العينة. عند تحديد موقع عينة ، استخدم برنامج المجهر متحد البؤر لتكبير برعم الزهرة محل الاهتمام للحصول على صورة. اضبط معلمات التصوير وحدد الجزء العلوي والسفلي من مكدس Z ثم انتقل إلى تصوير برعم الزهرة.

للاستئصال بالليزر من الكؤوس البريمورديا ، قم بتبديل مسار الضوء إلى الكاميرا المرتبطة بنظام الاستئصال بالليزر. بعد ذلك ، استخدم برنامج نظام الاستئصال بالليزر لتحديد منطقة الاستئصال. ثم اضبط طاقة الليزر ووقت الإقامة على المعلمات المناسبة لاستئصال ما يكفي من الخلايا دون إلحاق الكثير من الضرر بالأنسجة الأساسية ثم ابدأ الاستئصال.

إذا كان سيتم إجراء تجارب الفاصل الزمني ، فقم بصب الماء وتغطية الطبق لمنع الجفاف بين النقاط الزمنية للتصوير. ثم ضع العينات في ظروف الثقافة المناسبة. تسمح معظم الأنظمة متحدة البؤر بتصوير اثنين من الفلوروفورات ذات أطياف الانبعاث غير المتداخلة معا مثل GFP أو YFP إما مع يوديد البروبيديوم أو FM4-64.

أن أفضل الأنظمة متحدة البؤر قادرة أيضا على فصل الفلوروفورات المتعددة بأطياف الانبعاث المتداخلة جزئيا في نفس العينات مثل GFP أو YFP و DsRed ويوديد البروبيديوم كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية. هنا ، يتم عرض أمثلة على تجارب الفاصل الزمني مع براعم الزهور التي تطورت بشكل طبيعي بعد الاستئصال الذراعي باستخدام نظام الاستئصال بالليزر أو يدويا باستخدام ملزمة دبوس ودبوس معدني. منعهم الاستئصال بالليزر للبريموديا العظمية الناشئة لبرعم الزهرة هذا من تغطية نسيج الإنشاف الزهري الذي لا يزال من الممكن تصويره في المرحلة الخامسة.

على العكس من ذلك ، في برعم الزهرة هذا ، أدى الاستئصال بالليزر إلى تأخير نمو الكؤوس فقط ، على الرغم من أن الكؤوس نمت في النهاية لتغطي معظم النسيج الإنشائي للزهرة بحلول المرحلة الخامسة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير نبات الأرابيدوبسيس للتصوير متحد البؤر لبراعم الزهور الحية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخراج كل من البيانات النوعية والكمية من الصور متحد البؤر باستخدام برامج تحليل صور مختلفة.

ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال تنمية النبات على استكشاف ديناميكيات التعبير الجيني وانقسام الخلايا وتكوين الأعضاء في الأزهار الحية النامية.