Forskolin-الناجم عن تورم في الأمعاء Organoids: ل في المختبر الفحص لتقييم الاستجابة للدواء في التليف الكيسي المرضى

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم وظيفة CFTR الفردية في فعالية علاجات تعديل CFTR باستخدام تورم الناجم عن فورسكولين, أو اختبار FIS, في العضيات المعوية الناتجة عن مرضى التليف الكيسي. تتناول هذه الطريقة الأسئلة الرئيسية في مجال التليف الكيسي. وعلى الأخص أنه يساعد في تحديد المرضى الذين يمكن أن يستفيدوا على المدى الطويل من الأدوية الحالية أو التجريبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام الأنسجة التي يمكن الوصول إليها بسهولة لتوليد العضيات من أي مريض بالتليف الكيسي بغض النظر عن العمر. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج تقويم العظام للتليف الكيسي ، وتلبي الحاجة الحالية الملحة لاختبار فعالية الدواء بطريقة فعالة من حيث التكلفة وفردية. سيظهر الإجراء مارفن ستاتيا من Hubrecht Organoid Technology و Annelot Vonk من مجموعة Jeffrey Beekman.

للحصول على بيانات فحص التورم الناجمة عن فورسكولين الأمثل, من الضروري العمل مع ثقافة تحتوي على العضيات الكبيرة مع براعم متعددة. بعد تحديد مثل هذه الثقافة ، قم بتسمية أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مليلتر باسم العينة وأنبوب واحد على أنه مغسول. بعد ذلك ، استخدم ماصة p1000 لشفط الوسط بعناية من آبار الثقافة العضوية دون إزعاج قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي.

وأضف ملليلتر واحد من الوسط القاعدي إلى كل بئر. استخدم الآن الماصة لتفتيت قطرات مصفوفة الغشاء القاعدي في كل بئر، ونقل المعلقات العضوية الناتجة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر مع اسم العينة. اشطف كل بئر بملليمتر آخر من الوسط القاعدي واسحب الغسالات في أنبوب العينة.

عندما يتم جمع جميع العينات، املأ أنبوب العينة بحجم نهائي قدره 12 مل بوسط قاعدي واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر مبللة مسبقا لخلط المحلول. بعد ذلك ، قم بتثبيت العضيات ، وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من الوسط القاعدي الطازج. قم بتغطية نفس طرف الماصة p1000 بطرف p10 بدون مرشح وحاول تقييم التعليق 20 مرة.

ثم تخلص من كلا الطرفين واستخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لإضافة أربعة ملليلتر من الوسط القاعدي الطازج إلى العينة. قم بإمالة الأنبوب حوالي 70 درجة، واخلط المحلول بقوة مرتين إلى ثلاث مرات باستخدام طرف الماصة p1000 الجديد المبلل مسبقا. امسك الأنبوب في الوضع المائل لمدة 10 ثوان.

ثم استخدم نفس الماصة p1000 لنقل المليلتر العلوي من العينة إلى الأنابيب المغسولة أربع مرات. بعد حصاد العينة الأخيرة ، اجمع العضيات عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 120 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي بنسبة 50٪. ثم ضع قطرة سعة ثلاثة ميكرولترات على شريحة مجهر زجاجي وتأكد من وجود ما لا يقل عن 30 إلى 50 عضوية داخل القطرة تحت المجهر الضوئي.

بعد ذلك ، ضع ثلاثة قطرات ميكرولتر من الأوراغانويد في منتصف كل بئر من صفيحة بئر 96 ، وضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ مصفوفة الغشاء القاعدي. ثم أضف إما 100 ميكرولتر من القولون المتوسط الكامل بالإضافة إلى VX809 ، أو وسط القولون الكامل وحده إلى الآبار العضوية المناسبة ، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 18 إلى 24 ساعة. في اليوم التالي، استخدم ماصة مكرر لإضافة 10 ميكرولترات من محلول الكالسيوم إلى كل بئر، وأعد تعليق الآبار مرة واحدة باستخدام ماصة متعددة القنوات للتأكد من خلطها، وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة أخرى.

أثناء تلطيخ الخلايا ، قم بضبط أداة التصوير الحي مسبقا على المجهر متحد البؤر لتصوير الخلايا الحية إلى 37 درجة وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لاحتضان غرفة التصوير مسبقا. في نهاية الحضانة ، انقل اللوحة إلى حامل اللوحة على المجهر متحد البؤر واستخدم خيار الإعداد الذكي لتحديد مسار Alexa floor 488. بعد ذلك ، اضبط منطقة العدسات والمسح الضوئي الخمس السابقة على 0.6x للتصغير والتقط البئر بأكمله.

اضبط قوة الليزر وحساسية الكاشف لتمكين الكشف الأمثل عن العضيات ذات العلامات الخضراء الكالسيوم على الخلفية. واضبط عمق البت على ثمانية وحجم الإطار على 512 × 512 بكسل. استخدم خيار السلسلة الزمنية لتعيين وقت القياس والتردد والفواصل الزمنية.

وخيار البلاط لتحديد مواضع البئر الفردية يدويا. أضف الآن 100 ميكرولتر من فورسكولين المعدة حديثا, و أو VX770 إلى الآبار المقابلة, بدءا من البئر الأول ليتم تصويره, وبدء القياس. بسبب الخلل الوظيفي في التليف الكيسي التوصيل عبر الغشاء منظم التوجيه, أو CFTR, معظم العضيات التليف الكيسي القولون هي المدمجة في الحجم وإما لا تنتفخ أو تظهر تورم قليلا جدا 60 دقيقة بعد تحفيز فورسكولين, اعتمادا على النمط الجيني الخاص بهم.

ومع ذلك, عندما يتم التعامل مع العضيات التليف الكيسي مع المغيرين CFTR قبل تحفيز فورسكولين, العضيات يحمل زيادة في التورم. لتحديد التورم ، يمكن قياس إجمالي مساحات سطح الكالسيوم الخضراء في كل نقطة زمنية. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تكتمل هذه التقنيات في غضون ثلاث أو أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

قبل محاولة هذا الإجراء ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي تحسين ظروف الثقافة للعضيات المعوية ، لأن الثقافات ذات النوعية الجيدة ستحدد الأداء الأمثل لمقايسة FIS. بعد مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العمل مع الثقافات العضوية المعوية وقياس نشاط CFTR واستجابة المغيرين CFDR باستخدام اختبار التورم الناجم عن فورسكولين.