Name: عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: تعلم عزل جزر لانغرهانس من بنكرياس الفئران حديثة الولادة باستخدام الكولاجيناز. هذه الطريقة البسيطة تتيح الحصول على 20-80 مجموعة جزيرية سليمة لدراسات إفراز الأنسولين وتعبير الجينات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل بمنحة من NIDDK (DK065949 ل GG). نشكر الدكتورة بريندا إم جارفيس وجيف دوريا جونيور على قراءة المخطوطة.

استخدام الحيوانات يتبع الإجراءات المنصوص عليها في بروتوكول M / 11/181 التي وافق عليها فاندربيلت المؤسسات ورعاية الحيوان واستخدام اللجنة لقو. تم شراء CD1 أو CBA / BL6 الفئران من الباعة التجارية وعبروا في منشأة الحيوان فاندربيلت للحصول على الفئران حديثي الولادة. 1. إعداد الفئران، سهم حلول ومعدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالصليب الماوس: انشاء عبر الماوس وتسجيل مواعيد توصيل للمساعدة في تخطيط التجريبية. الفئران CD1 عادة ما تلد حول يوم 19 بعد التزاوج. استخدام CD1 أو CBA / BL6 يعبر الحصول على CD1 أو CBA / BL6 حديثي الولادة، على التوالي. Intercrosses بين الخطين الاستفادة من الإناث والذكور CD1 CBA / BL6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسهم كولاجيناز: تزن 200 ملغ كولاجيناز النوع الرابع برصيد عالية الدقة. نقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تذوب في 40 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ (1.26 و 0.5 ملم على التوالي) لجعل 5 ملغ / مل محلول المخزون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح كولاجيناز لحل ل~ 30 دقيقة مع اهتزاز لطيف. قسامة والحفاظ على حل المجمدة في -20 درجة مئوية والأوراق المالية، والتي تبقى نشطة لمدة سنة على الأقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف لتعقيم عدة أزواج من ملاقط، مقصات، ونصائح P20 للتشريح وقطف جزيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسهم الجلوكوز 1 M: وزن 9 ز الجلوكوز في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة 50 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام إلى حل الجلوكوز. نضع في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، ولكن ليس أكثر من 6 أشهر. </li></ol> 2. حلول العمل ملاحظة: يوم من العزلة جزيرة، وإعداد الكواشف التالية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنوع كولاجيناز حل رابعا العمل: ذوبان الجليد وتمييع الأسهم كولاجيناز على الجليد. الاستغناء 0.15 الأسهم مل في كل microfuge أنبوب مل 1.7. إضافة 1.35 مل HBSS مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. عكس الأنبوب 5 مرات. ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور بسرعة عالية لمدة 3 دقائق في microcentrifuge. نقل طاف لأنبوب جديد. ترك على الجليد حتى الاستخدام. تجاهل أنبوب مع الحطام غير قابلة للذوبان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكامل RPMI 1640 وسائل الإعلام: إضافة 2.5 مل 1 M جلوكوز، 50 مل الحرارة المعطل FBS و 5 مل الأسهم 100X القلم بكتيريا إلى 500 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام. ترك على الجليد حتى الاستخدام. </li></ol> 3. عزل البنكرياس والهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء حديثي الولادة مع isoflurane، تليها قطع الرأس وفقا لبروتوكولات المعتمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماوس مع بطنها مواجهة. رذاذ مع الايثانول 70٪ لتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الجلد حتى البطن مع ملاقط وقطع الجلد والعضلات طبقات طوليا على طول خط الوسط مع زوج من مقص، من منطقة الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري. هذا يفتح تجويف البطن لفضح جميع الأعضاء الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جميع الأعضاء الداخلية إلى صحن 100 سم مع زوج من ملاقط. تحديد موقع البنكرياس، الذي يقع على بعد الجهاز المنتشرة مع جزء الظهرية أن يتمسك المعدة والطحال وجزء بطني أن يتمسك الاثني عشر (11). </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة HBSS في طبق لغمر الأجهزة. في الحل، وأنسجة البنكرياس لم يعد التمسك الاثني عشر والمعدة، أو الطحال. فمن التعرف عليها بسهولة تحت نطاق تشريح بسبب لونه الأبيض المعتاد. استخدام زوج من ملاقط لقشر أنسجة البنكرياس بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها، ونقلها إلى طبق جديد 60 ملم مع HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل البنكرياس مع مقص الى قطع أصغر من 5 ملم عبر أي أبعاد. نقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ما يصل الى خمسة بنكرياسات (الذين تقل أعمارهم عن P7) يمكن هضمها في أنبوب واحد. بالنسبة للفئران P8-P16، استخدام أنبوب واحد في البنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 - حل العمل 1 مل كولاجيناز لكل أنبوب (0.2 مل لكل البنكرياس P1-P7 استخدام 0.5 مل لكل البنكرياس P8-P16). ترك الأنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 15 دقيقة. عكس الأنبوب مرتين كل دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ~ 5 دقائق، والاستفادة من أنبوب لمراقبة حالة هضم أنسجة البنكرياس. مواصلة عملية الهضم حتى أكثر من البنكرياسيبدو الأنسجة مجموعات الخلايا كما مجزأة، مع قطر &lt;2 مم. سوف تظهر المحللة غائم، والذي يرجع إلى وضعها الطبيعي انحلال ذاتي خلية عنيبية. </li></ol> 4. المحللة الغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور المحللة في 500 x ج لمدة 10 ثانية في microcentrifuge. إزالة طبقة طاف مع pipetman P1،000. يجب أن تظهر طاف العكرة ولكن خالية من مجموعات الخلايا. لا تستخدم الطموح، والتي قد نضح بسرعة بعيدا شظايا الأنسجة في الجزء السفلي بسبب وجود بعض الحمض النووي لزجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل RPMI 1640 وسائل الإعلام كاملة. الاستفادة من أنبوب بلطف إلى resuspend والمحللة مجزأة. عكس صعودا وهبوطا 10 مرات. كرر الخطوة 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.2 مرتين أخريين أو حتى يظهر طاف واضح. اعادة تعليق أجزاء البنكرياس غسلها في 1 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام. </li></ol> 5. جزيرة العزلة ملاحظة: للحصول على أعداد صغيرة من بنكرياسات، ومن ناحية اختيار المباشرة على النحو التالي (5.1) يمكن استخدامها لISOL جزيرةأوجه. لأعداد كبيرة من بنكرياسات (&gt; 6)، ويفضل الطريقة الموضحة في 5.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشر ناحية قطف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة من الخطوة 4.3 إلى صحن 60 ملم. إضافة 5 مل كاملة RPMI 1640 وسائل الإعلام. يجمع تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإضاءة الحقل مشرقة على المجهر. ضبط شدة الضوء إلى ~ 50٪ من الطاقة القصوى. تحت هذا الشرط، تظهر الجزر كما قليلا مجموعات الوردي، في حين أن خلايا عنيبية مجموعات على شكل غير النظامية، والظلام (الشكل 1A). ينصح التكبير من ~ 50X (الجمع بين قوة الهدف وعدسة المجهر) لتقديم أفضل وسيلة لجزر تصور وافتتاح طرف الماصة في وقت واحد لاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الجزر مع P20 ماصة مع تجنب التجمعات عنيبية. كسور الاستغناء الجزر التخصيب إلى طبق جديد 60 ملم مع RPMI وسائل الإعلام كاملة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية قطف اليد مرتين أكثر. ترك الجزر النقية في 60 الجديدطبق ملم مع 4 مل وسائل الاعلام RPMI كاملة (الشكل 1C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي التدرج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل التي تم تحميلها مسبقا مع 2 مل polysucrose والصوديوم دياتريزوات في كثافة 1.077 غرام / مليلتر. ترك الأنبوب على الجليد حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق من الخطوة 4.3 على الجزء العلوي من polysucrose والصوديوم حل دياتريزوات مع ماصة باستور. لا تخل الطبقة السفلية. الأنسجة من ما يصل الى 10 المولود حديثا أو 2 P17 بنكرياسات يمكن تحميلها في كل أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنبوب في ~ 600 x ج في البديل الدوار لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. استخدام إعدادات قبالة الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، ونقل وسائل الإعلام وطبقات البيني (لاحظ أنه في ظل ظروف التشغيل المثالية، سوف يكون موجودا في الجزر في الطور البيني بين polysucrose والثقافة وسائل الإعلام بعد الطرد المركزي) إلى جديد 15 مل أنبوب. إضافة 10 مل سائل الإعلام، مزيج بلطف ولكن بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل جزء التخصيب جزيرةفي 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة وسائل الإعلام غسل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت مع وسائل الاعلام RPMI كاملة. الكريات Resuspend في 4 مل وسائل الإعلام، والتي في معظمها يحتوي على الجزر والقنوات (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومن ناحية اختيار الجزر على النحو المبين في القسم 5.1. </li></ol></li></ol> 6. فحوصات هيئة التأمين في الفشوت المعزولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجزر من الخطوة 5.1.4 في وسائل الإعلام RPMI كاملة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة لإزالة RPMI تحت المجهر تشريح. إضافة 3 مل من محلول KRB مع 2.8 ملي الجلوكوز إلى لوحة 3. دوامة 10 مرات لغسل الجزر. إزالة حلول KRB. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار عملية الغسيل مرة واحدة. احتضان الجزر مع 3 مل من محلول KRB عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل KRB في كل بئر من لوحة ال 12 أيضا. قبل تدفئة الأسهم KRB ولوحة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الجزر مرتين مع درجة حرارة ما قبل KRB كما في 6.2. عبرفر 10 الجزر إلى كل بئر من لوحات ما قبل تحسنت. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر من طاف. ويتضمن هذا الحل الأنسولين يفرز تحت الجلوكوز القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 32 ميكرولتر 500 ملي الجلوكوز. دوامة لوحة 20 مرات لخلط الحل. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية. دوامة لوحة 5 مرات مرة واحدة كل 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45 دقيقة، وسحب 50 ميكرولتر طاف. هذا هو الأنسولين يفرز تحت ارتفاع نسبة الجلوكوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جميع الجزر إلى أنبوب 1.5 مل. تجميد في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تكرار عملية التجميد والذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل 70٪ من الإيثانول مع 20 ملم حمض الهيدروكلوريك. ترك بين عشية وضحاها. هذا هو الانسولين اليسار في الجزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ELISA التقليدية لفحص مستويات الانسولين، التي سبق وصفها 3. </li></ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة للعمل الموصوف.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة على عزلة جزيرة من بنكرياسات التي هي صغيرة جدا لنضح التقليدية. ومن المتوقع أن تسفر عن الجزر جاهزة لجميع الدراسات القائمة على جزيرة مثل تنقية خلايا بيتا، تحليل التعبير الجيني، جزيرة نضوج خلايا بيتا، والانتشار، استجابات التوتر الخلية، وبقاء الخلية، والتمثيل الغذائي، وصيانة التأمين الحكومية الوظيفية وغيرها. وسيكون هذا، لعلمنا، أول بروتوكول البصري المفصل الذي يوجه الباحثين الجدد لأداء عزل خلايا البنكرياس من الفئران حديثي الولادة. من دون هذه م...

يعد عزل جزر البنكرياس النقية أمرا ضروريا لفحص إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) لخلايا بيتا ولزرع الجزر الصغيرة من المتبرعين بالجثث 1-3. من الضروري أيضا إنشاء تعبير جيني للغدد الصماء في خلايا الجزيرة 4 ، 5. لهذا الغرض ، تم وضع بروتوكولات مفصلة للسماح بعزل جزر البنكرياس عن البنكرياس الكبير (6 والمراجع الواردة فيه). تعتمد هذه الطرق على التروية الأنزيمية لفصل الأسينار عن أنسجة الجزر ، إلى جانب فصل التدرج والانتقاء اليدوي. وبالتالي ، يمكن إجراء عزل الجزر من البنكرياس الكبير بسهولة في معظم المختبرات. من ناحية أخرى ، لا يوجد بروتوكول مفصل خطوة بخطوة للسماح بعزل الجزر الصغيرة جدا عن البنكرياس التي لا يمكن فتحها.
 من المهم دراسة التعبير الجيني ووظيفة جزر حديثي الولادة. الجزر الصغيرة حديثة الولادة لها خصائص مختلفة عن البالغين في إفراز الأنسولين والقدرة على الانتشار 7 ، 8. ومع ذلك ، فإن عزل الجزر الصغيرة عن المولودة حديثا ، وخاصة الفئران يمثل تحديا بسبب صغر حجم البنكرياس المولود حديثا. يمنع الحجم عملية التروية المعتادة عند حقن الكولاجيناز من خلال قناة البنكرياس. في الواقع ، قدمت العديد من الأوراق دراسات على هذا المنوال ، مع إجراءات العزل بمساعدة الإنزيم أو غير الإنزيم 7 ، 9 ، 10. ومع ذلك ، فإن الوصف التفصيلي لعملية عزل الجزيرة بالمساعدة البصرية يفتقر إلى 7 ، 9 ، مما يجعل إجراء دراسات مماثلة تحديا لمعظم الباحثين. 
لقد استكشفنا العديد من الحالات المختلفة التي تنتج جزرا عالية الجودة من الفئران حديثي الولادة. نقدم هنا بروتوكولا من المتوقع أن يساعد الباحثين على معرفة التفاصيل الأساسية في عملية عزل الجزر. ينطبق هذا البروتوكول على بنكرياس الفئران حتى عمر أسبوعين ، وبعد ذلك يمكن إجراء التروية لعزل الجزر الروتينية. يمكن استخدام الجزر مباشرة لإفراز الأنسولين ومقايسات التعبير الجيني.

<table><tbody><tr><td>كولاجيناز النوع الرابع</td><td>سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MO</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS مع Ca2 + / Mg2 + </td><td>Mediatech / Cellgro ، Manassas ، VA</td><td>MT21020CV</td><td>إذا تم الحصول على HBSS مع Ca2 + / Mg2 + ، يمكن إضافة CaCl 2 و MgSO4 إلى 1.26 و 0.5 ملي مولار ، على التوالي.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 w / o glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific / Life Technologies ، Waltham ، MA</td><td>11879-020</td><td>يجب إضافة الجلوكوز إلى مستويات محددة حتى لا يتداخل مع الاستخدام اللاحق للجزيرة.</td></tr><tr><td>الجلوكوز</td><td>سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MO</td><td>G-7021 &nbsp ؛</td><td></td></tr><tr><td>محلول عديد السكروز ودياتريزوات الصوديوم</td><td>Sigma Aldrich ، سانت لويس ، MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Carl-Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica ، Wetzlar ، ألمانيا</td><td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي</td><td>الدقيقة Eppendorf ، Hauppauge ، NY</td><td>جهاز طرد مركزي 5417C</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد مركزي</td><td>Eppendorf، Hauppauge ، NY</td><td>أجهزة الطرد المركزي 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15-mL أنابيب الطرد المركزي</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-ML أنابيب الطرد المركزي</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>التوازن الدقيق</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد الدقيق</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific ، &nbsp ؛ Waltham ، MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific ، &nbsp ؛ والثام ، ماساتشوستس</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>طبق 100 × 15 مم</td><td>VWR ، رادنور ، بنسلفانيا</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>طبق 60 × 15 مم</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>12 بئر ألواح</td><td>VWR ، Radnor ، PA</td><td>665-180</td><td></td></tr> أدوات <tr><td>علمية دقيقة مقص ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا</td><td>14080-11</td><td></td><td></td></tr> أدوات <tr><td></td><td>علمية دقيقة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>CD1 الفئران</td><td>تشارلز ريفر مختبرات ، ويلمينتون ، ماساتشوستس & nbsp ؛</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>مختبر جاكسون ، فارمنجتون ، CT & nbsp ؛</td><td>C57BL / 6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1 / J</td><td>مختبر جاكسون ، فارمنجتون ، CT & nbsp ؛</td><td>B6CBAF1 / J</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

وراسخة وبروتوكولات جزيرة العزلة القائمة على نضح من بنكرياسات الثدييات الكبيرة. وتجرى هذه البروتوكولات بسهولة في العديد من المختبرات نظرا لحجم كبير من القناة البنكرياسية التي تسمح للحقن كولاجيناز جاهزة ونضح الأنسجة لاحق. في المقابل، جزيرة العزلة من بنكرياسات صغير، مثلها في ذلك مثل الفئران حديثي الولادة، يمثل تحديا لنضح هو غير قابل للتحقيق في بنكرياسات الصغيرة بسهولة. نحن هنا وصف الإجراء بسيط مفصل أن يسترد أعداد كبيرة من الجزر من الفئران الوليدة بمساعدة البصرية. تم هضمها تشريح حديثا بنكرياسات كله مع 0.5 ملغ / مل كولاجيناز الرابع الذائبة في هانكس &quot;محلول الملح المتوازن (HBSS) عند 37 درجة مئوية، في أنابيب microcentrifuge. تم استغلالها أنابيب بانتظام للمساعدة في تشتيت النسيج. عندما فرقت معظم الأنسجة في مجموعات صغيرة حوالي 1 ملم، وكانت تغسل لست] 3-4 مرات مع وسائل الإعلام والثقافة مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). مجموعات خلايا البنكرياس،تخلو من الأنسجة عنيبية التعرف عليها، ومن ثم يمكن استردادها تحت تشريح المجسام. هذه الطريقة للشفاء 20-80 الصغيرة والجزر الكبيرة الحجم في البنكرياس من الماوس ولدوا حديثا. هذه الجزر هي مناسبة لفحوصات المصب أكثر يمكن تصورها، بما في ذلك إفراز الأنسولين، التعبير الجيني، والثقافة. وقدم مثالا على فحص إفراز الأنسولين للتحقق من صحة عملية العزل. الخلفية الوراثية ودرجة الهضم هي أكبر العوامل التي تحدد العائد. ويفضل تقدم طازجة حل كولاجيناز مع ارتفاع النشاط، كما أنها تساعد في عزلة الغدد الصماء الإفرازية. وجود الكاتيونات [الكالسيوم (الكالسيوم 2+) والمغنيسيوم (مغ 2+)] في كل الحلول ومصل بقري جنيني في غسل / ضرورية لمحصول جيد من الجزر مع السلامة المناسبة وسائل الاعلام اختيار. وهناك نطاق تشريح مع تباين جيد والتكبير يساعد أيضا.

تحت الظروف المثلى، يمكن أن الطريقة المعروضة تسفر 20-80 الجزر من البنكرياس كل فأر صغير. يعتمد هذا العدد على خلفية وراثية، وعمر الفئران، وحجم الجزر التي سيتم استردادها. بين يشيع استخدامها، CD1 خارج لدت وC57BL / 6J الفئران الأصيلة تنتج أقل الجزر مع حجم أصغر من الهجينة بين CD1 وC57BL / 6 أو B6CBAF1 التجارية / J الفئران تفعل. ومن ناحية المباشرة اختيار عموما قدم عدد أصغر من الجزر، من المحتمل بسبب استبعاد من الجزر الصغيرة التي يمكن أن يكون من الصعب التعرف...

نحن تصف بروتوكول هنا لعزل الجزر سليمة من الفئران حديثي الولادة. تم هضمها بنكرياسات جزئيا مع كولاجيناز، تليها الغسيل وقطف اليد. ويمكن الحصول على 80 مجموعات جزيرة في البنكرياس من الفئران الوليدة، والتي هي مناسبة لعدة دراسات خلايا البنكرياس - 20.

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل جزر لانجرهانز السليمة من بنكرياس فأر حديث الولادة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتطور والوظيفة، مثل إفراز الإنسولين، والتعبير الجيني، وبقاء الخلايا، والحفاظ على الوظيفة.تكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في بساطتها ووضوحها، مع السماح للباحثين الجدد بعزل عدد كبير من الجزر السليمة لإجراء دراسات لاحقة. ابدأ برش حديث الولادة في وضعية الاستلقاء على الظهر بـ 70% ethanol. بعد ذلك، استخدم الملاقط لرفع الجلد فوق منطقة البطن، ثم قص طبقات الجلد والعضلات طولياً على طول الخط الناصف من الأعضاء التناسلية وصولاً إلى القفص الصدري.بعد ذلك، انقل جميع الأعضاء الداخلية إلى طبق سعة 100 سنتيمتر وحدد موقع البنكرياس، وهو عضو أبيض متشتت يتكون من جزء بطني يلتصق بالاثني عشر وجزء ظهري يلتصق بالمعدة والطحال. أضف HBSS إلى الطبق لغمر الأعضاء بحيث لا تعود أنسجة البنكرياس ملتصقة بالاثني عشر أو المعدة أو الطحال. ثم استخدم ملقطاً لفصل البنكرياس عن الأنسجة المحيطة.انقل البنكرياس إلى طبق جديد بقطر 60 millimeter يحتوي على HBSS، واستخدم المقص لتقطيع من بنكرياس واحد إلى خمسة بنكرياسات إلى قطع بحجم 5 millimeter أو أصغر. وعندما يتم فرم جميع الأنسجة، انقل القطع إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة بسعة 1.5 milliliter وأضف محاليل الكولاجيناز التشغيلية إلى العينات. ثم حضن شظايا الأنسجة عند درجة حرارة 37 degrees celsius، مع قلب الأنابيب مرتين كل دقيقة.بعد مرور خمس دقائق، قم بالنقر على الأنبوب لمراقبة حالة هضم القطع. استمر في عملية الهضم لمدة عشر دقائق أخرى، حتى يصبح المستخلص الخلوي عكراً وتظهر معظم البنكرياسات على هيئة تجمعات خلوية مجزأة يقل قطرها عن 2 mm. وفي نهاية عملية الهضم، قم بترسيب المستخلص الخلوي عن طريق الطرد المركزي الدقيق، واستخدم ماصة p1000 لإزالة السائل الطافي بعناية، والذي يجب أن يظهر عكراً ولكن خالياً من التجمعات الخلوية.بعد ذلك، أضف 1 mL من وسط RPMI 16/40 الكامل الطازج إلى الراسب. ثم انقر برفق لإعادة تعليق قطع المُنحل المتفتت واقلب الأنبوب عشر مرات. بعد الطرد المركزي، اقلب المُنحل المعاد تعليقه مرتين إضافيتين على الأقل كما تم توضيحه للتو حتى يصبح الطافي رائقاً.بعد ذلك، أعد تعليق الراسب النهائي في 1 ml من الوسط الكامل الطازج، وأضف 2 ml من البوليسكروز ودياترازوات الصوديوم بكثافة 1.077 g/ml إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml على الثلج. وباستخدام ماصة باستور، ضع الطبقة المحللة بعناية فوق محلول التدرج دون خلط الطبقات، ثم افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. انقل الوسط وطبقات الواجهة البينية التي تحتوي على الجزر إلى أنبوب جديد سعة 15 ml، واخلط الجزر بلطف ولكن بدقة مع 10 ml من الوسط الطازج تمهيداً للطرد المركزي.بعد إجراء غسلة ثانية وإضافة وسط غذائي كامل جديد، أعد تعليق الراسب الذي يحتوي على الجزر والقنوات في 4 mL من الوسط الغذائي الكامل الجديد. والآن، قم باستزراع الجزر في طبق قطر 60 mm وأضف 5 mL من الوسط الغذائي الكامل إلى الخلايا. انقل الطبق إلى مجهر تشريحي وقم بتشغيل إضاءة الحقل المضيء مع ضبط شدة الضوء لتكون حوالي 50% من الطاقة القصوى.عند تكبير بمقدار 50x، ستظهر الجزر كعناقيد وردية فاتحة، بينما تظهر الخلايا العنيبية كعناقيد داكنة غير منتظمة الشكل. وباستخدام طرف ماصة p20، يتم جمع الجزر الفردية مع الحرص على تجنب العناقيد العنيبية، ونقل الأجزاء الغنية بالجزر إلى طبق جديد بقطر 60 مليمتر يحتوي على وسط غذائي كامل. وعند الانتهاء من التقاط جميع الجزر من الطبق الأصلي، تُجمع الجزر من طبق التجميع وتُنقل إلى طبق جديد بقطر 60 مليمتر يحتوي على 4 مل من وسط غذائي كامل وطازج، وتُكرر هذه العملية مرتين إضافيتين، حتى لا يتبقى في طبق التجميع النهائي سوى جزر نقية.يؤدي الهضم والعزل الصحيحان إلى الحصول على جزر ذات أسطح خارجية ملساء. قد يؤدي الهضم غير الكافي بإنزيم collagenase إلى تكوّن جزر كبيرة يمكن رؤيتها بسهولة ولكن لا يمكن فصلها تمامًا عن الأنسجة العنيبية، مما يقلل من المحصول الإجمالي للجزر على الرغم من إنتاج جزر أكبر حجمًا. أما في حالة الهضم المفرط، فبالرغم من إمكانية فصل الأنسجة العنيبية تمامًا عن الجزر، إلا أن بنية الجزر تصبح عرضة للتلف، مما يؤدي إلى ظهور جزر ذات أسطح خشنة عند فحصها تحت المجهر.تُظهر الجزر البنكرياسية حديثة الولادة التي تم عزلها بهذه الطريقة مستويات عالية من إفراز الإنسولين الأساسي، مع أنماط إفراز إنسولين محفزة بالجلوكوز نموذجية لخلايا بيتا غير الناضجة في الجزر، مما يشير إلى أن إجراء عزل الجزر هذا يحافظ إلى حد كبير على الخصائص الوظيفية للجزر حديثة الولادة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين فقط إذا نُفذت بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء طرد مركزي مسبق للـ collagenase لإزالة أي حطام غير قابل للذوبان، واستخدام محلول غسيل مُدعم بالـ calcium والـ magnesium، واستخدام محلول غسيل مُعالج مسبقاً من أجل إيقاف تفكك الأنسجة بسرعة.في هذا الإجراء، يمكن إجراء تجاربنا، مثل إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز، للإجابة على أسئلة إضافية مثل ديناميكيات إفراز الإنسولين في خلايا بيتا حديثة الولادة. كما يمهد هذا التكنيك الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا خلايا بيتا لإجراء اختبارات إضافية، مثل التعبير الجيني أو دراسات أيضية أخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل جزر البنكرياس السليمة من بنكرياس الفئران حديثة الولادة لدراساتك اللاحقة.تذكر أن التعامل مع مسحوق الكولاجيناز (collagenase) ينطوي على مخاطر شديدة، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات وقناع الوجه دائمًا عند استخدام هذه المادة.

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

وقد اقترح زرع الجزر المعزولة لتكون المعاملة المحتملة للاصابة بداء السكري من النوع 1. نحن هنا وصف الأسلوب لعزل الجزر من بنكرياسات الماوس وزرع لهم في الفضاء تحت المحفظة في الكلى.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراسات الأساسية والسريرية.

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

يوصف وصفا مفصلا لعزل جزيرة الماوس باستخدام تقنية في كيفية تركيب الكانيولا في البنكرياس القنوي الموقع ونضح من مجموعة من تنقية الأنزيم البروتيني كولاجيناز ومحايدة.

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

جزر البنكرياس ، وتسمى أيضا جزر لانجرهانز ، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج هرمونات لتنظيم الجلوكوز والوظائف البيولوجية المهمة الأخرى. يشرح هذا البروتوكول طريقة لعزل جزر البنكرياس عن طريق نشر الكولاجيناز أولا عبر أمبولا فاتر لهضم أنسجة البنكرياس الخارجية والطرد المركزي المتدرج المبسط لتنقية الجزر من الفئران.

عزل جزر البنكرياس من خلال نضح الكولاجيناز: طريقة إنزيمية لعزل خلايا جزر البنكرياس

يعاير في المختبر وظيفة β-الخلية باستخدام الماوس الجزر المعزولة لانجرهانز هو عنصر هام في دراسة الفيزيولوجيا المرضية السكري والعلاجات. في حين أن العديد من التطبيقات المتاحة المصب، ويصف هذا البروتوكول على وجه التحديد قياس الخلايا أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم) كمعلمة أساسية تحديد وظيفة خلايا β.

وهناك طريقة للماوس البنكرياس جزيرة العزلة وبين الخلايا المخيم تقدير

نقدم هنا بروتوكولا لعزل الجزر الصغيرة عن نموذج الفأر لمرض السكري من النوع 2 ، Leprdb وتفاصيل اختبار الخلايا الحية لقياس إفراز الأنسولين من الجزر السليمة التي تستخدم 2 مجهر فوتون.

Lepr<sup&gt; ديسيبل</sup&gt; نموذج الفأر من النوع 2 من مرض السكري: البنكرياس عزل جزيرة وتعيش خلية 2 فوتون التصوير من الجزر سليمة

هذا البروتوكول يوضح الفئران العزلة جزيرة والبذر على سقالة ديسيلولاريزد. تم زرع الجزر التي تدعم سقالة في لوحة الدهون البربخ من ستريبتوزوتوسين (ستز) التي يسببها الفئران السكري. نجت الجزر في موقع الزرع وعكست حالة فرط سكر الدم.

تدعمه سقالة زرع الجزر في سادة الدهون البربخ من الفئران السكري

وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.

بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران

زرع البنكرياس جزيرة ليلى وسيلة لتحقيق نورموجليسيميا في مرض السكري من النوع 1. تركز هذه المقالة على تقنية زرع الأعضاء من خلال توجيه إينترابورتال للحفاظ على مستويات السكر العادي في الفئران السكري.

إينترابورتال زرع جزيرات البنكرياس في طراز الماوس

طورت هذه الدراسة طريقة مبسطة لاستخراج الجزر الأولية الوظيفية والخلايا الأسينارية بكفاءة من بنكرياس الفأر، مما يوفر أداة قيمة لدراسة التواصل بين الخلايا في مسببات مرض السكري الحاد الناتج عن التهاب البنكرياس.

طريقة بسيطة وسريعة للعزل المتزامن للجزر الأولية وخلايا البنكرياس الأولية من الفئران

يصف هذا البروتوكول طريقة موحدة للحصاد الجراحي، والهضم الإنزيمي، وتنقية جزر لويس البنكرياسية بالتدرج الكثافتي، مما يتيح من استخدام التحضيرات عالية الإنتاجية والنقاوة للاستخدام المباشر في الدراسات الزرعية أو في المختبر .

عزل وتنقية جزر البنكرياس من فئران لويس باستخدام الهضم الإنزيمي وفصل الكثافة والتدرج

تعلم عزل جزر لانغرهانس من بنكرياس الفئران حديثة الولادة باستخدام الكولاجيناز. هذه الطريقة البسيطة تتيح الحصول على 20-80 مجموعة جزيرية سليمة لدراسات إفراز الأنسولين وتعبير الجينات.

عزل فعال من الجزر وظيفية من الأطفال حديثي الولادة البنكرياس ماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات