قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة بسيطة لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا وإمكانات غشاء الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الميتوكوندريا ، مثل كيفية عمل الميتوكوندريا كمخازن كالسيوم محلية لتنظيم تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بإحكام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس إمكانات كالسيوم الميتوكوندريا وغشاء الميتوكوندريا على وجه التحديد في وقت واحد في خلايا الحياة دون الحاجة إلى التلاعب الجيني.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم الكالسيوم في أمراض الميتوكوندريا ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة الحالات التنكسية الأحدث الأخرى ، عندما يكون تنظيم الكالسيوم في المبولة أمرا بالغ الأهمية. في هذا الإجراء ، قم بزراعة الخلايا على أطباق زراعة الخلايا التي يبلغ طولها عشرة سنتيمترات ، أو قوارير 75 سنتيمترا مربعا ، في وسط الاستزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لحصاد الخلايا ، قم بإزالة الوسائط عن طريق الشفط ، واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS عن طريق الشفط. ثم أضف 1.5 مل من Trypsin EDTA ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، اضغط على الطبق برفق لإزالة الخلايا.

أعد تعليقها في خمسة ملليلتر من وسائط الاستزراع. بعد ذلك ، عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. في اليوم السابق للتصوير متحد البؤر ، قم بوضع الخلايا عند التقاء 60 إلى 70 في المائة في الأطباق أو زلات الغطاء الحجرية.

ثم احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق والتعافي. في هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول تلطيخ السجل باستخدام TMRM و Fluo 4 AM والفاعل بالسطح. قم بإزالة وسائط الثقافة واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS واحتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول التلوين القياسي لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التلوين القياسي وغسل الخلايا في 100 ميكرولتر من HBSS الخالي من الكالسيوم لإزالة Fluo 4 AM و TMRM الزائد. ثم قم بإعداد محلول التخيل داخل الخلايا باستخدام الديجيتونين و TMRM و thapsigargin.

بعد ذلك ، قم بإزالة HPSS الخالي من الكالسيوم وأضف 300 ميكرولتر من محلول التصوير العضلي إلى الخلايا. اترك الخلايا تتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق قبل التصوير بإضافات كلوريد الكالسيوم. استخدم طاقة ليزر منخفضة تبلغ حوالي 5 بالمائة لتقليل أي تلف للصور للخلايا.

استخدم الإعداد الموجود على ليزر المجهر لأطياف الإثارة والانبعاث ل TMRM و Fluo 4 AM. استخدم طاقة ليزر منخفضة تبلغ حوالي خمسة بالمائة مع كسب مرتفع لتقليل تلف الصور للخلايا. بعد ذلك ، اضبط المجهر على مسح الصور ضوئيا كل خمس وعشرين ثانية. امسح الخلايا ضوئيا لمدة عشر دقائق لتحديد قراءات الخط الأساسي لإشارات TMRM و Fluo 4.

ثم أوقف مسح الصورة مؤقتا وأضف 3 ميكرولترات من محلول مخزون كلوريد الكالسيوم 40 مليمولار مباشرة إلى الخلايا في 300 ميكرولتر من محلول التصوير العضلي العضلي. تخلط برفق باستخدام ماصة. عند إضافة محلول الكالسيوم إلى الخلايا ، احرص على عدم تحريك الطبق على مرحلة المجهر.

استمر في مسح الصور لمدة أربع دقائق تقريبا. ثم كرر إضافات كلوريد الكالسيوم كل أربع دقائق حتى يتم الوصول إلى إشارات TMRM أو Fluo 4 المطلوبة ، وعادة ما تكون حوالي ثمانية إلى عشر إضافات. بعد ذلك ، أضف 1 إلى 100 تخفيف من واحد مللي مولار FCCP مباشرة إلى الخلايا لتبديد إمكانات الغشاء الداخلي.

ثم قم بتصوير الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى قبل انتهاء التجربة. بمجرد اكتمال التصوير ، حدد شدة إشارات Fluo 4 و TMRM باستخدام برنامج تحليل الصور. للقيام بذلك ، افتح الصورة ، وانقر فوق أداة التحديد وحدد منطقة الاهتمام التي تحتوي على الميتوكوندريا.

يمكن تحديد مناطق متعددة ذات أهمية للقياس عن طريق فتح Analyze, Tools, ROI Manager. انقر فوق إضافة لتضمين عائد الاستثمار المحدد لقياس الكثافة. كرر الخطوات السابقة حتى تتم إضافة جميع عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار.

قم بقياس متوسط شدة الفلورسنت لإشارات TMRM و Fluo 4 لكل منطقة ذات أهمية عن طريق تحديد وظيفة القياس المتعددة. تأكد من تحديد قياس جميع الشرائح، وإلغاء تحديد صف واحد لكل شريحة. ثم انقر فوق موافق للحصول على جدول متوسط شدة الفلورسنت لإشارات TMRM و Fluo 4 لكل عائد استثمار في كل نقطة زمنية.

ثم اجمع البيانات لحساب متوسط الشدة والانحراف المعياري لإشارات TMRM و Fluo 4. في هذه التجربة ، تم تحميل خلايا 143B مسبقا ب Fluo 4 AM و TMRM قبل النفاذية مع الديجيتونين. بعد كل إضافة لكلوريد الكالسيوم ، تنخفض إشارة TMRM حيث يؤدي تدفق أيونات الكالسيوم إلى الميتوكوندريا إلى تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا.

يتضح احتمال الغشاء الصغير بعد انتقال النفاذية حيث أن إضافة 10 ميكرومولار FCCP لا تزال تحفز انهيار إمكانات الغشاء. هنا يبدأ تركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا ، المشار إليه بإشارة Fluo 4 ، في الزيادة بعد إضافة كلوريد الكالسيوم الثانية عندما يصل الكالسيوم الحر في الوسائط إلى 0.32 ميكرومولار. تسببت كل إضافة لاحقة لكلوريد الكالسيوم في زيادة تدريجية في كالسيوم الميتوكوندريا.

تظهر هنا صور القياسات المتزامنة لإمكانات الغشاء في الكالسيوم في الميتوكوندريا. تشير الإشارة الحمراء إلى TMRM وتشير الإشارة الخضراء إلى Fluo 4. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا وإمكانات غشاء الميتوكوندريا في وقت واحد على الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام إضافة الكالسيوم الخارجي إلى الخلايا المنفذة. لا تنس أن العمل مع FCCP و digitonin يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند تنفيذ هذا الإجراء.