دراسة الظواهر المضيف في affinis الجمبوزيا وبعد المضادات الحيوية العلاج

الهدف العام لهذا النظام التجريبي هو فحص الآثار الجانبية السلبية للكائن الحي المضيف بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الميكروبيوم ، مثل الآثار الجانبية المرتبطة ب enbac على صحة المضيف والتي يتم بوساطة الميكروبيوم المعطل. لذا فإن المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن هذا النظام مباشر وغير مكلف في فحص الأنماط الظاهرية الفسيولوجية للمضيفين الفقاريين ، ويسمح بتعطيل غير جراحي للميكروبيوم المخاطي.

الآثار المترتبة على هذه التقنية كيف يمكن أن يؤدي الاضطراب في ميكروبيوم إلى آثار جانبية كبيرة. للبدء ، قم بربط سلالة معدية تم الحصول عليها ومجمدة مسبقا من Edwardsiella ictaluri على E.Ictaluri أجار متوسط انتقائي وتفاضلي. احتضان المزرعة عند 27 درجة مئوية لمدة يومين.

انقل مستعمرة معزولة نقية من المزرعة وقم بتطعيم قارورة سعة 150 مل تحتوي على 40 مل من مرق المغذيات. ضع القارورة في حاضنة اهتزاز عند 27 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة يومين. بعد الحضانة ، لمعايرة مزرعة E.Ictaluri لأحجام الجرعات المعدية المرغوبة ، استخدم PBST لتخفيف عينة من المزرعة إلى OD 650 من 0.2.

بعد جمع Gambusia affinis ، ومعالجة الأسماك بالريفامبيسين في عمود الماء لمدة ثلاثة أيام ، قم بنقل كل من مجموعات الأسماك الشاهدة المعالجة بالمضادات الحيوية وغير المعالجة إلى أكواب بلاستيكية فردية تحتوي على 130 مل من مياه البركة الاصطناعية العذبة ، أو APW ، لمدة 10 ساعات تقريبا لإزالة الدواء من أنسجة الأسماك. بعد ذلك ، افصل السمك مرة أخرى إلى أكواب بلاستيكية فردية سعة ثمانية أونصات تحتوي على 130 مل من APW النظيف. يتم إعطاء جرعة مميتة من استزراع الإيكتالوري لكل سمكة واحتضان الأسماك عند 27 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد حمام E.Ictaluri ، انقل كل سمكة إلى كوب جديد يحتوي على 130 مل من APW. بدون إطعام الأسماك ، سجل معدل وفيات الأسماك على مدار أسبوع. اجمع البراز الذي تم جمعه في كيس بلاستيكي معقم قبل نقله إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر ، ثم استخدم PBST لإنشاء تركيز مخزون من البراز عند 500 إلى 800 ملليغرام لكل مليلتر ، باستخدام ماصة بلاستيكية واحدة أو أكبر مع قطع الطرف ، قم بإعداد 130 مل لكل كوب من 15 ملليغرام لكل مليلتر أو 10 ملليغرام لكل مليلتر من البراز في APW.

نقل الأسماك المعالجة بالمضادات الحيوية أو غير المعالجة إلى أكواب فردية من المحلول ، ثم احتضان الأسماك عند 25 درجة مئوية لمدة يومين ، مع مراقبة وتسجيل الوفيات عن كثب خلال هذا الوقت. لمعالجة الأسماك بالتربة ، اجمع كيلوغراما إلى كيلوغراما من التربة السطحية العضوية الغنية ، حوالي سبعة بعمق 15 سم ، وانقلها إلى وعاء بلاستيكي نظيف. قم بإعداد أكواب بلاستيكية فردية تحتوي على 18.2 جراما من التربة و 130 مل من APW ، وخلط التربة جيدا يدويا ، ثم انقل المضاد الحيوي المعالج أو غير المعالج إلى الأكواب واتركه عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام مع تسجيل أي وفيات.

بعد فترة راحة مدتها 10 ساعات في APW بعد العلاج بالمضادات الحيوية ، قم بنقل الأسماك إلى أكواب فردية تحتوي على 17.5 ملليغرام لكل مليلتر من كلوريد الصوديوم و APW ، ومراقبة الأسماك على مدى 36 ساعة للوفيات ، لتنفيذ تحدي سمية النترات ، بعد فترة راحة مدتها 10 ساعات كما كان من قبل ، افصل الأسماك إلى أكواب فردية تحتوي إما على 10 أو 17.5 ملليغرام لكل مليلتر من نترات الصوديوم و 130 مليلتر من APW. راقب الأسماك على مدار يوم واحد للوفيات عند جرعة عالية من نترات الصوديوم ، وأربعة أيام للأسماك بالجرعة المنخفضة. بعد الانتهاء من التعرض للمضادات الحيوية أو التحكم لمدة ثلاثة أيام في مجموعات ، بالنسبة للأسماك الفردية ، املأ ثمانية أونصات من أكواب الستايروفوم ب 150 مل من APW ، وبعد وزن الأكواب المملوءة ، انقل السمك إلى الأكواب ، ثم سجل إجمالي وزن الجسم للتقييم الأولي.

قم بإطعام الأسماك يوميا بحبيتين من الطعام لكل سمكة ، وراقب الاستهلاك عن طريق تسجيل الكريات غير المأكولة بصريا. في نهاية كل أسبوع على مدار أربعة أسابيع ، حدد وزن السمكة عن طريق وزن كوب من APW الطازج أولا وتسجيل الوزن ، ثم صب السمك في شبكة غمس ، وانقله إلى الكوب الجديد ، قبل وزن الكوب مرة أخرى. بالنسبة لمجموعات الأسماك ، ضع 150 مل من APW في كوب وقم بتفريغ الميزان.

احتفظ بالأسماك معا في كلتا المجموعتين عند نقلها إلى حاويات جديدة من APW ، ثم سجل الوزن الإجمالي للمجموعة. كرر الوزن في نهاية كل أسبوع على مدار شهر. لتحليل وقت عبور الأمعاء ، أضف 360 ميكرولتر من الماء المعقم منزوع الأيونات و 52 ملليغرام من الجيلاتين في أنبوب معقم سعة 1.7 مليلتر ، وضعه على كتلة حرارية 60 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين ويذوب تماما.

باستخدام مدقة ومدقة ، قم بطحن رقائق طعام السمك الذهبي إلى مسحوق ناعم ، وأضف 40 ملليغراما من المسحوق إلى الأنبوب مع 20 ميكرولترا من زيت السمك. بعد الخلط ، أضف 1.6 ملليغرام من ديكستران FitC. قم بتوزيع 20 قطرة ميكرولتر من السائل الساخن على البارافيلم على مقعد المختبر ، واتركها تبرد وتتصلب بسرعة.

ضع البارافيلم على نصف طبق بتري وقم بتعويمه على ماء معقم داخل وعاء بلاستيكي محكم الغلق. قم بتخزين القطرات الصلبة في الثلاجة لمدة تصل إلى أربعة أيام قبل أن تصبح صعبة جدا على الأسماك تناولها. قبل الرضاعة مباشرة ، استخدم شفرة حلاقة لتقطيع القطرات إلى أرباع أقسام.

تأقلم الأسماك مع أكواب الستايروفوم الفردية لمدة يومين دون إطعام ، ضع أربعة أرباع الطعام في كوب السمك ، وراقب السمك لمدة 30 دقيقة لمعرفة عدد قطع الطعام التي يأكلها كل منهما. لبدء المراقبة ، قم بنقل الأسماك الفردية إلى أكواب تحتوي على 80 مل من APW ، وكل ساعتين ، خذ عينة 1 ملليلتر. قم بتخزينه في أنبوب 1.7 مليلتر عند أربع درجات مئوية.

بعد الانتهاء من الفحص ، ضع عينة كاملة من المليلتر واحد في كوفيت ، واستخدم مقياس الطيف الضوئي الفلوري لتسجيل التألق عند إثارة 495 نانومتر ، وانبعاث 520 نانومتر لجميع العينات في نفس الوقت. كما هو موضح هنا ، كانت الأسماك ذات الميكروبيوم المعدل بالمضادات الحيوية أكثر عرضة للإصابة بعدوى الإشريكية الإيكتالوري من أسماك التحكم. لم يكن الفرق في متوسط الوقت حتى الوفاة للأسماك المعالجة مقابل الأسماك الشاهدة كبيرا.

من المحتمل أن يكون هذا بسبب صغر حجم المجموعة. يوضح هذا الرسم البياني أن الأسماك المعرضة للريفامبيسين كانت أكثر عرضة للإجهاد التناضحي من الأسماك الضابطة ، مع هذا الفحص ، أدت مستويات الملوحة التي تزيد عن 18 ملليغرام لكل المليلتر إلى موت سريع للأسماك. كما هو موضح في هذا الجدول ، عند التعرض لنترات السم في عمود الماء ، لم يؤثر التعرض المسبق للعلاج بالمضادات الحيوية على البقاء على قيد الحياة.

عند 10 ملليغرام لكل مليلتر ، لوحظ 50٪ من الفتك لكل من المجموعات المعالجة بالمضادات الحيوية والمجموعات الضابطة في 90 ساعة. في هذه التجربة باستخدام أسماك التحكم في حوض السمك ، تم إطعام قسمين من الطعام المسمى FitC dextran، أو قسم واحد للأسماك لفحص وقت عبور الطعام عن طريق قياس التألق في المياه المحيطة بمرور الوقت. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس إجمالي مخازن الدهون في الجسم وتحديد إنتاج مخاط الجلد من أجل فهم الآليات ، وتضييق نطاق العوامل المربكة التي قد تساهم في تأثيرات المضيف السلبية.