يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على أدلة مكانية وزمانية كمية على التمركز المشترك لمستقبل الأنجيوتنسين من النوع الأول مع الليزوزوم بعد المعالجة بالأنجيوتنسين 2. وقد صُممت هذه الطريقة للكشف عن الاختلافات في المعالجة تحت الخلوية للمستقبلات من النوع Y مقابل المستقبلات الطافرة، وذلك أثناء عملية الإدخال الخلوي التي تحدث استجابةً لتحفيز اللجين. وتتمثل مزايا هذه التقنية في أن التصوير الحي للخلايا يلغي الشوائب الناتجة عن الخلايا المثبتة والمنفذة بواسطة المنظفات، كما يسمح بتقييم التغيرات الديناميكية في تمركز المستقبلات في الوقت الفعلي.

ابدأ باختيار عدسة شيئية ذات فتحة عددية 1.4 مناسبة وتوسيط العدسة فوق منصة المجهر. أضف قطرة من زيت غمر عالي اللزوجة ومنخفض الفلورة الذاتية على العدسة الشيئية، ثم انقل الحجرة التي تحتوي على الخلايا المنقولة إلى منصة المجهر. ارفع العدسة الشيئية برفق حتى يلامس الزيت الجزء السفلي من الشريحة الأولى، ثم حدد موقع الخلايا الخافتة.

عندما تكون الخلية السليمة المستهدفة في مركز مجال الرؤية، انتقل إلى وضع المجهر البؤري (confocal mode) وتأكد من أن الخلية منبسطة جيداً، مع ملاصقة جانبها البطني لغطاء الشريحة بشكل وثيق. افتح مربع حوار Z Stack، وانقر على Live، ثم ركز البؤرة على الجزء العلوي من الخلية، وبعد ذلك انقر على Begin. ثم ركز البؤرة على الجزء السفلي من الخلية، وأدخل حجم خطوة Z بقيمة 1.00 micrometer، ثم انقر على End.

بعد ذلك، اختر وضع XYZT من إعدادات الاستحواذ (Acquisition settings) في الأعلى. وأخيراً، حدد الفاصل الزمني للمسح ومدة المسح لمراقبة استهداف مستقبل Angiotensin Type 1A المرتبط بـ GFP نحو الجسيمات الحالة (lysosomes). لبدء تحفيز الربيطة، أضف 3 µL من محلول مخزون بتركيز 100 X من الربيطة إلى البئر الذي يتم تصويره، ثم انقر على Start لتصوير الاستجابة ثلاثية الأبعاد للفترة والتكرار المطلوبين.

لتحليل صور الخلايا الحية، افتح برنامج تقدير الكمية للصور ثلاثية الأبعاد المناسب. في هذا البروتوكول، استخدم برنامج Velocity. انقر بزر الماوس الأيمن داخل حقل الصورة واختر Properties.

أدخل خصائص بكسل الصورة المناسبة للمحاور XY وZ لإنشاء تسلسل قياس لتحليل شدة الخلايا والحويصلات المستقبلة الموسومة بـ GFP استجابةً للمعالجة بالرابط. من قائمة 2D، اختر وضع التركيز الممتد (extended focus mode) لمراقبة الخلية. بعد ذلك، استخدم أداة المنطقة الحرة (freestyle region tool) لرسم منطقة اهتمام حول الخلية، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة لاختيار "قص حسب التحديد" (Crop to Selection).

سيتم إنشاء عنصر صورة جديد. انقر فوق اسم الصورة لتحديد صورة الخلية المقصوصة وفتح علامة تبويب القياس. لقياس تعبير GFP في الحويصلات الممتصة، اسحب Find Objects من Finding إلى مربع التسلسل أعلاه.

اضبط قناة البحث عن الكائنات (find objects channel) على GFP، وافتح أيقونة الإعدادات لضبط العتبة (threshold) باستخدام الانحراف المعياري (standard deviation) والحد الأدنى على ستة، وذلك لاختيار الكائنات ذات شدة GFP الأعلى. اضبط الحد الأدنى لحجم الكائن على 0 µm³. بعد ذلك، انقر فوق قياس (measure)، واختر القنوات وأنواع القياسات.

لتحديد العتبة والمرشحات اللازمة لتحديد الخلية بأكملها وقياس شدة GFP الكلية، اسحب مربع Find Objects ثانٍ. بعد ذلك، اضبط قناة Find Objects على GFP واضبط الانحراف المعياري على صفر، لاختيار الأجسام ذات أي شدة GFP، واضبط الحد الأدنى لحجم الجسم على 2 µm³. اسحب Filter Population إلى مربع Find Objects الخاص بالمجموعة الثانية، واختر حجماً بـ µm³ يكون أكبر من 100 لتحديد الخلية بأكملها واستبعاد جميع الأجسام الأصغر.

بعد ذلك، اختر القياسات (measurements) وبند إجراء القياس (Make Measurement)، لإجراء القياس عند جميع النقاط الزمنية. ولتحليل تعبير GFP المقاس في الحويصلات والخلية بأكملها بمرور الوقت، انقر فوق اسم ملف بند القياس الموجود أسفل اسم الصورة. ولاستخراج بيانات GFP والحويصلات من إجمالي البيانات، افتح علامة التبويب "البيانات الخام" (raw) واختر المجتمع الأول (population one).

بعد ذلك، افتح علامة التبويب analyzed وانقر بزر الماوس الأيمن على البيانات، ثم اختر analysis، يليه restricting analysis لاختيار population one. ولقياس كمية GFP في الخلية بأكملها، قم بتغيير كليهما إلى population two. وتحت Analyze These Data وSummarized By، اختر sum GFP color channel، ثم sum.

بعد ذلك، ضمن خيار "تنظيم البيانات حسب" (Organize the data by) و"الصف" (row)، حدد "النقطة الزمنية" (time point). لاستخراج البيانات الخاصة بكمية GFP في الليسوسومات، وفي قسم "البحث عن الكائنات" (Find Objects) للمجموعة الأولى، اضبط قناة البحث عن الكائنات على القناة الحمراء. ومن خلال أيقونة العجلة الموجودة داخل مربع الحوار، اضبط "استخدام العتبة" (threshold using) على "الانحراف المعياري" (standard deviation)، والحد الأدنى على ستة، وذلك لاختيار الكائنات الحمراء ذات الكثافات الأكثر سطوعاً، واضبط الحد الأدنى لحجم الكائن على 0.017 micrometers cubed.

حدد القياسات، وقم بإنشاء عنصر قياس، لإجراء القياس عند جميع النقاط الزمنية. ولتحليل تعبير GFP المقاس في الليزوزومات، انقر فوق اسم ملف عنصر القياس الموجود أسفل اسم الصورة. حدد Population one ضمن علامة التبويب Raw، ثم حدد Population one وSum GFP color channel وSum ضمن علامة التبويب Analyze، مع النقر بزر الماوس الأيمن كما سبق لقياس كمية GFP في الحويصلات الحمراء.

قبل التحفيز بالربيطة، تتمركز مستقبلات الأنجيوتنسين من النوع 1A الموسومة ببروتين GFP بشكل أساسي في الغشاء البلازمي. ولكن في غضون 2.5 دقيقة من إضافة أنجيوتنسين 2، تصبح هذه المستقبلات مُستدخلة، حيث تُشكل حويصلات ساطعة ثم تتجمع لاحقاً لتكون حويصلات كبيرة حول النواة. وتؤدي التغضنات الناتجة عن تحفيز أنجيوتنسين 2 إلى تعقيد عملية قياس شدة GFP الكلية في الحويصلات، كما هو ملاحظ في بيانات قياس تعبير GFP التمثيلية هذه.

لا يفرق الترشيح الحجمي بين الثنيات الأكبر والحويصلات المتكتلة، ولكنه يكشف أن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الأجسام الأصغر يزداد في وقت أبكر مما يزداد في الأجسام الأكبر. وفي هذا المسار الزمني التمثيلي للتعبير عن GFP بدون التركيز التلقائي، تم قياس GFP الممتص كنسبة مئوية من إجمالي GFP الخلوي. وقد كشف تحليل إجمالي GFP داخل الخلية أن هذه الخلية لم تتعرض لبهتان ضوئي ملموس بمرور الوقت.

يشير قياس كمية GFP في ليزوزومات الخلايا المنقولة أيضاً إلى أن شدة مستقبل أنجيو-تنسين من النوع 1A الموجود داخل الليزوزومات لا تتغير لمدة تصل إلى 24 دقيقة بعد إعطاء Angiotensin two. خلال هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة صحة الخلايا قبل وأثناء التصوير، وبما أن الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً، فيجب إيقاف التجربة إذا كانت المزارع الخلوية غير طبيعية بأي شكل من الأشكال. وبعد هذا الإجراء، يمكن استخدام التلوين المناعي وFRET أو FLIM للكشف عن التموضع تحت الخلوي للمستقبلات وتأكيده.

يمكن إجراء لطخات ويسترن (Western blots) للتحقق من هوية وتغيرات جزيئات الإشارة المشاركة أثناء نقل المستقبلات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الحي للخلايا والتحليل لقياس استهداف المستقبلات عبر الغشائية الناجم عن الربيطة نحو الليزوزومات، وكذلك نحو المقصورات تحت الخلوية الأخرى.