يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

الهدف العام من هذه التجربة هو الحصول على دليل كمي ومكاني وزماني على تحديد موقع الليزوزوم الليزوسوم من النوع الأول لمستقبلات الأنجيوتنسين من النوع الأول بعد العلاج الأنجيوتنسين الثاني. تم ابتكار هذه الطريقة للكشف عن الاختلافات في المعالجة تحت الخلوية من النوع Y مقابل المستقبلات الطافرة ، كما هو الحال أثناء عملية الاستيعاب ، والتي تنطق استجابة لمحاكاة الترابط. من مزايا هذه التقنية أن تصوير خلايا الحياة ، يزيل القطع الأثرية من الخلايا الثابتة والمنظفات المنفذة وأن التغييرات الديناميكية في توطين المستقبلات يمكن تقييمها في الوقت الفعلي.

ابدأ بتحديد هدف الفتحة العددية المناسب 1.4 وتوسيط الهدف على مرحلة المجهر. أضف قطرة من اللزوجة العالية ، وزيت الغمر التلقائي المنخفض إلى الهدف وانقل الغرفة مع الخلايا المنقولة إلى مرحلة المجهر. ارفع الهدف برفق حتى يلامس الزيت الجزء السفلي من الشريحة الأولى وحدد موقع الخلايا الخافتة.

مع وجود خلية صحية ذات أهمية ، في وسط مجال الرؤية ، قم بالتبديل إلى الوضع متحد البؤر وتأكد من أن الخلية منتشرة بشكل جيد ، مع جانبها البطني جنبا إلى جنب مع زلة الغطاء. افتح مربع الحوار Z Stack، وانقر فوق مباشر، وركز على الجزء العلوي من الخلية، ثم انقر فوق ابدأ. ثم ركز على الجزء السفلي من الخلية، وأدخل حجم الخطوة Z 1.00 ميكرومتر، ثم انقر فوق إنهاء.

ثم حدد وضع XYZT ضمن إعدادات الاكتساب في الأعلى. أخيرا ، قم بتعيين الفاصل الزمني للفحص وطول الوقت للمسح لمراقبة استهداف مستقبلات الأنجيوتنسين من النوع 1A الموسومة ب GFP إلى الجسيمات الحالة ثم لبدء تحفيز الترابط ، أضف ثلاثة ميكرولترات من محلول مخزون 100 X من الترابط إلى البئر الذي يتم تصويره وانقر فوق ابدأ لتصوير الاستجابة ثلاثية الأبعاد للفترة والتردد المطلوبين.

لتحليل صور الخلية الحية ، افتح برنامج قياس صورة ثلاثية الأبعاد المناسب. في هذا البروتوكول ، السرعة. انقر بزر الماوس الأيمن داخل حقل الصورة وحدد خصائص.

أدخل خصائص بكسل الصورة XY و Z المناسبة لإنشاء تسلسل قياس لتحليل حوصلة المستقبل الموسومة ب GFP ، وشدة خلايا الثقب استجابة لمعالجة الترابط. ضمن القائمة 2D ، حدد وضع التركيز الموسع لمراقبة الخلية. بعد ذلك ، استخدم أداة منطقة النمط الحر ، لرسم منطقة اهتمام حول الخلية ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الصورة لتحديد اقتصاص للتحديد.

سيتم إنشاء عنصر صورة جديد. انقر فوق اسم الصورة لتحديد صورة الخلية التي تم اقتصاصها وافتح علامة تبويب القياس. لقياس تعبير GFP للحويصلات الداخلية ، اسحب Find Objects from Finding إلى مربع التسلسل أعلاه.

اضبط قناة البحث عن الكائنات على GFP وافتح أيقونة الإعدادات لتعيين الحد باستخدام الانحراف المعياري والحد الأدنى إلى ستة، لتحديد الكائنات ذات شدة GFP الأكثر سطوعا. اضبط الحد الأدنى لحجم الكائن على صفر ميكرومتر مكعب. ثم انقر فوق قياس ، وحدد القنوات وأنواع القياسات.

لتحديد العتبة والمرشحات لتحديد الخلية بأكملها ولقياس إجمالي شدة GFP، اسحب مربع Find Objects ثان. بعد ذلك ، قم بتعيين قناة البحث عن الكائنات على GFP وقم بتعيين الانحراف المعياري إلى الصفر ، لتحديد الكائنات ذات أي شدة GFP والحد الأدنى لحجم الكائن إلى ميكرومتر مكعب. اسحب Filter Population إلى مربع Population two Find Objects وحدد حجم ميكرومتر مكعب ، أكبر من 100 لتحديد الخلية بأكملها وإزالة جميع الكائنات الأصغر.

ثم حدد القياسات وقم بإجراء عنصر القياس ، لإجراء القياس في جميع النقاط الزمنية. لتحليل تعبير GFP المقاس في الحويصلات ، والخلية بأكملها بمرور الوقت ، انقر فوق اسم ملف عنصر القياس أسفل اسم الصورة. لاستخراج بيانات GFP والحويصلات من إجمالي البيانات ، افتح علامة التبويب الأولية وحدد السكان واحد.

بعد ذلك ، افتح علامة التبويب التي تم تحليلها وانقر بزر الماوس الأيمن على البيانات ، وحدد التحليل ، متبوعا بتقييد التحليل لتحديد السكان الأول. لقياس مقدار GFP في الخلية بأكملها ، قم بتغيير كلاهما إلى السكان الثانيين. ضمن تحليل هذه البيانات وتلخيصها بواسطة، حدد مجموع قناة ألوان GFP ومجموع.

ثم ضمن تنظيم البيانات حسب الصف، حدد النقطة الزمنية. لاستخراج البيانات الخاصة بمقدار GFP في الجسيمات الحالة ، في البحث عن كائنات للسكان الأول ، قم بتعيين قناة البحث عن الكائنات على القناة الحمراء. في أيقونة العجلة داخل مربع الحوار، قم بتعيين الحد باستخدام الانحراف المعياري، والحد الأدنى إلى ستة، لتحديد الكائنات الحمراء ذات الشدة الأكثر سطوعا، والحد الأدنى لحجم الكائن إلى 0.017 ميكرومتر مكعب.

حدد القياسات ، وقم بعمل عنصر قياس ، لإجراء القياس في جميع النقاط الزمنية. لتحليل تعبير GFP المقاس في الجسيمات الحالة ، انقر فوق اسم ملف عنصر القياس أسفل اسم الصورة. حدد المحتوى واحد ضمن علامة التبويب الأولية ، ثم حدد السكان واحد ومجموع قناة ألوان GFP والمجموع ضمن علامة التبويب تحليل ، والنقر بزر الماوس الأيمن كما كان من قبل لقياس مقدار GFP في الحويصلات الحمراء.

قبل تحفيز الترابط ، يتم توطين مستقبلات الأنجيوتنسين من النوع 1A الموسومة ب GFP في الغالب في غشاء البلازما. ولكن في غضون 2.5 دقيقة من إضافة الأنجيوتنسين الثاني ، يتم استيعاب هذه المستقبلات ، وتشكل حويصلات ساطعة ثم تتجمع لاحقا وحويصلات شبه نووية كبيرة. يعقد الكشكشة المستحثة الأنجيوتنسين الثانية التقدير الكمي لكثافة الحويصلة الإجمالية GFP كما لوحظ لبيانات قياس تعبير GFP التمثيلية هذه.

لا تميز تصفية الحجم بين الكشكشة الأكبر والحويصلات العنقودية ، ولكنها تكشف أن GFP في الكائنات الأصغر تزداد في وقت أقرب من GFP في الكائنات الأكبر. في هذه الدورة الزمنية التمثيلية لتعبير GFP بدون ضبط تلقائي للصورة ، تم قياس GFP الداخلي على أنه النسبة المئوية لإجمالي GFP الخلوي. كشف تحليل إجمالي GFP داخل الخلية أن هذه الخلية لم تقم بتصوير التبييض بشكل ملحوظ بمرور الوقت.

يشير القياس الكمي ل GFP في الجسيمات الحالة للخلايا المنقولة أيضا إلى أن شدة مستقبلات الأنجيوتنسين من النوع 1A الموجودة داخل الجسيمات الحالة ، لا تختلف لمدة تصل إلى 24 دقيقة بعد إعطاء الأنجيوتنسين مرتين. أثناء هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة صحة الخلايا قبل وأثناء التصوير ، نظرا لأن الإجراء يستغرق وقتا طويلا ، فيجب إجهاض التجربة إذا كانت مزارع الخلايا غير طبيعية بأي شكل من الأشكال. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام التلوين المناعي و FRET أو FLIM لاكتشاف وتأكيد توطين المستقبلات تحت الخلوية.

يمكن إجراء اللطخات الغربية لمعالجة الهوية والتغيرات في جزيئات الإشارات المتضمنة أثناء تهريب المستقبلات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير الخلايا الحية وتحليلها لقياس مستقبلات الغشاء المستحثة عن الترابط التي تستهدف الجسيمات الحالة وكذلك المقصورات الفرعية الأخرى.