استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

يتمثل الهدف العام لهذا الإجراء التجريبي في استخدام جسيم نانوي قائم على البلورات السائلة كمنصة توصيل للتوصيل الموجه لشحنة كارهة للماء إلى الجزء المحب للدهون من الغشاء البلازمي للخلايا الثديية الحية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال توصيل الأدوية، مثل كيفية تمكين التوصيل والامتصاص الخلوي للشحنات الكارهة للماء وضعيفة الذوبان في الماء بكفاءة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح توصيلاً أكثر تحديداً للشحنات الكارهة للماء التي تستهدف الغشاء إلى الغشاء البلازمي، مقترناً بانخفاض سميتها الخلوية.

سيقوم الدكتور أوخيل ناج، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بتحضير جسيمات DiO النانوية من البلورات السائلة كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، أضف 20 µL من محلول العمل المُحضّر حديثاً من NHSS/EDC إلى 1.0 mL من جسيمات DiO النانوية من البلورات السائلة في محلول HEPES المنظم.

ثم قلّب الخليط لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 20 µL من المحلول المخزون لـ cholesterol PEG amine إلى هذا المزيج وقلبه لمدة ساعتين. وبعد مرور الساعتين، قم بطرد مركزي سريع لخليط التفاعل بالسرعة القصوى لمدة 30 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مكتبي.

ثم مرر السائل الطافي عبر عمود كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي PD 10 الذي تمت موازنته باستخدام محلول Dulbecco's phosphate buffered saline. وللتأكد من نجاح الاقتران التساهمي لـ PEG cholesterol بسطح جسيمات DiO النانوية البلورية السائلة عن طريق الرحلان الكهربائي الهلامي، قم بتحضير هلام أغاروز كما هو موضح في البروتوكول النصي. وبمجرد أن يتصلب الهلام، أضف كمية كافية من منظم TBE التشغيلي لغمر الهلام داخل الغرفة.

بعد ذلك، أضف 35 µL من عينة جسيمات DiO النانوية من البلورات السائلة إلى آبار الهلام وشغل الجهاز لمدة 20 دقيقة عند جهد 110 volts. قم بتصوير الهلام باستخدام نظام تصوير الهلام مع مرشح إثارة عند 488 nanometers ومرشحات انبعاث من 500 إلى 550 nanometers. قم بتجهيز أطباق زراعة أنسجة بقطر 35 millimeter مزودة بقطع زجاجية غطائية رقم 1 بقطر 14 millimeter عن طريق طلائها بـ bovine fibronectin في DPBS لمدة ساعتين عند 37 °C.

بعد مرور ساعتين، قم بإزالة محلول طلاء الفيبرونيكتين من طبق الزرع. يتم حصاد خلايا HEK 293 T17 من قارورة T25 عن طريق غسل الطبقة أحادية الخلايا أولاً باستخدام 3 mL من DPBS، ثم إضافة 2 mL من trypsin EDTA. تُحضن القارورة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ثلاث دقائق تقريبًا.

بمجرد فصل الخلايا عن القارورة، يتم تحييد التريبسين عن طريق إضافة أربعة ملليلتر من الوسط الكامل إلى القارورة. حدد تركيز الخلايا في المعلق عن طريق عدها باستخدام عداد الخلايا. ثم اضبط تركيز الخلايا ليصل إلى 80,000 خلية تقريباً لكل ملليلتر باستخدام وسط النمو.

أضف ثلاثة milliliters من معلق الخلايا إلى الطبق، ثم قم بالتحضين في الحاضنة طوال الليل. وفي اليوم التالي، يجب أن تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ 70% تقريباً وتصبح جاهزة للاستخدام. وتعد كثافة الخلايا الكافية أمراً بالغ الأهمية لضمان وسم نسبة عالية من الخلايا بشكل قوي وفعال.

قم بتحضير محاليل بحجم 1 mL من DiO، وجسيمات DiO النانوية ذات البلورات السائلة، وجسيمات DiO النانوية ذات البلورات السائلة المرتبطة بـ PEG cholesterol، وذلك في وسط التوصيل عن طريق تخفيف المحاليل الأصلية المقابلة. قم بإزالة وسط النمو من أطباق الزراعة باستخدام ماصة سيرولوجية، واغسل الطبقات الخلوية الأحادية مرتين باستخدام HEPES DMEM. قم بإجراء عمليات الغسل باستخدام ماصة لإضافة HEPES DMEM برفق إلى حواف الأطباق، ثم قم بإزالته.

أضف 0.2 milliliters من محاليل توصيل الجسيمات النانوية البلورية السائلة DiO أو المحاليل الخالية من DiO المُحضرة إلى مركز أطباق الزرع. بعد ذلك، أعد الأطباق إلى الحاضنة لفترة زمنية مناسبة. تؤدي فترات التحضين الأطول إلى وسم خلوي غير محدد للمناطق غير الغشائية.

بعد فترة التحضين، قم بإزالة محاليل التوصيل باستخدام ماصة سيرولوجية. اغسل الطبقات الخلوية الأحادية مرتين باستخدام DPBS بمعدل 2 mL لكل غسلة. قم بتثبيت الطبقات الخلوية الأحادية باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

أزل محلول البارافورمالدهيد باستخدام ماصة واغسل الخلايا بلطف لمرة واحدة باستخدام 2 mL من DPBS. الآن أصبحت الخلايا المثبتة جاهزة للتصوير للتحقق من وجود إشارة فلورية غشائية، وذلك باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر. على منصة مجهر مجهزة بحجرة تحضين ساخنة، قم بتصوير عينة الخلايا الحية باستخدام مجهر بؤري لتقييم وسم الغشاء.

إذا لم يتم إجراء التصوير على الفور، استبدل الوسط بـ DPBS يحتوي على 0.05% من أزيد الصوديوم واحفظ الأطباق عند درجة حرارة 4 °C. في هذه الطريقة، يتم وسم الخلايا بشكل مشترك باستخدام DiO كمانح FRET، و DiI كمستقبل FRET. قم بوسم الخلايا بالتتابع باستخدام جسيمات DiO النانوية من البلورات السائلة بولي إيثيلين جلايكول كوليسترول، و DiI الحر كما سبق.

بعد التلوين، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 mL من محلول DPBS بواسطة ماصة سيرولوجية، ثم استبدله بـ 2 mL من محلول تصوير الخلايا الحية. وعلى منصة مجهر مجهزة بغرفة حضانة مسخنة، قم بتصوير عينة الخلايا الحية باستخدام مجهر كونفوكال مع تصوير FRET. اضبط التجربة لتتم على فترات زمنية مدتها 30 دقيقة على مدار فترة زمنية تبلغ أربع ساعات، وذلك عن طريق إثارة المانح DiO عند 488 nanometers، وجمع أطياف الانبعاث الكاملة لكل من المانح DiO والمستقبل DiI من 490 إلى 700 nanometers، باستخدام كاشف طيفي مكون من 32 قناة.

بعد ذلك، يتم تحديد شدة الانبعاث المحلولة زمنياً لكل من المانح DiO والمستقبل DiI من الخلايا المصبوغة بـ DiO liquid crystal nanoparticle PEG cholesterol و DiI. وأخيراً، يتم حساب نسبة FRET للمستقبل والمانح المحلولة زمنياً للصور كما هو موضح في البروتوكول النصي. يتراكم DiO الحر بشكل غير محدد في الجزء الداخلي من الخلية، بدلاً من الأغشية البلازمية للخلايا التي تم صبغها صبغاً مضاداً باستخدام فوسفوليبيد غشائي مزدوج الوسم.

يمكن تصور ذلك من خلال الصور المدمجة. وعلى العكس من ذلك، فإن جسيمات الكريستال السائل النانوية PEG cholesterol المحملة بـ DiO تصبغ تحديداً الغشاء البلازمي للخلية، كما يتضح من التوضع المشترك مع الفوسفوليبيد الغشائي المصبوغ مزدوجاً. ويؤكد انتقال الطاقة الرنيني الفلوري (FRET) انتقال DiO من جسيم الكريستال السائل النانوي إلى الطبقة المزدوجة من ليبيدات الغشاء من خلال الزيادة الملحوظة في نقل الطاقة من المانح DiO إلى المستقبل DiI.

يؤكد انتقال الطاقة الرنيني الفلوري (FRET) بين DiO و DiI، بالإضافة إلى التغيرات في انبعاثات DiO و DiI، زيادة الـ FRET من DiO إلى DiI كدالة في الزمن. وتظهر جسيمات DiO النانوية المكونة من البلورات السائلة والـ PEG cholesterol الحد الأدنى من السمية الخلوية بنسبة حيوية بلغت 90%، مقارنة بسمية ملحوظة لـ DiO الحر بنسبة حيوية تبلغ حوالي 50%. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع جسيمات نانوية من البلورات السائلة محملة بالشحنات، وإضفاء الوظائف الحيوية عليها لاستهداف الخلايا، وتصوير الخلايا المحملة بالشحنات للتحقق من نجاح التوصيل الخلوي.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن التوصيل المحدد لـ DiO من المحلول المائي إلى الغشاء البلازمي يمثل تحدياً كبيراً. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد استخدام منصة الجسيمات النانوية من البلورات السائلة للتوصيل الخلوي لعقار doxorubicin المضاد للسرطان، حيث لاحظنا قدرتها على تعديل حركية الامتصاص الخلوي للعقار. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تطبيق هذا النهج للتوصيل الخلوي لمجموعة واسعة من الشحنات الكارهة للماء التي تشكل تحدياً خاصاً فيما يتعلق بتوصيلها إلى الخلايا من الأوساط المائية.

يمكن استخدام هذا النهج لتحقيق توصيل أكثر كفاءة للأدوية والجزيئات النشطة بيولوجياً التي تستهدف الغشاء، مثل الأصباغ الحساسة للجهد المستخدمة في تصوير الدماغ، أو الأدوية الديناميكية الضوئية المستخدمة في العلاج الدوائي المدعوم بالفوتونات.