Name: ل فيفو السابقين طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: اكتشف نموذج زراعة مساري الجرذ لتصوير شبكات الأوعية الدقيقة بالتصوير الزمني. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الخلايا البطانية وتأثيرات الأدوية المضادة للأوعية في بيئة فسيولوجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة 5-P20GM103629 إلى WLM ومركز تولين للشيخوخة. نود أن نشكر ماثيو نيس على مساعدته في تحرير نص البروتوكول.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

<html> هذا البروتوكول يوثق طريقة لاستخدام نموذج الثقافة الفئران مساريق كأداة خارج الجسم الحي للتصوير الوقت الفاصل بين النمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. وقد أنشأت الأعمال السابقة في مختبرنا استخدام نموذجنا لل1) الأوعية الدموية 8، 2) lymphangiogenesis 8، 3) التفاعلات خلية خلية حوطية البطانية 8، و 4) المضادة للعائية اختبار المخدرات 9. القدرة لتصوير أنسجة الفئران مساريق مثقف في نق...

نمو شبكة الاوعية الدموية الدقيقة، وإعادة عرض وقواسم مشتركة من أجل وظيفة الأنسجة، والتئام الجروح، وأمراض متعددة وعملية رئيسية هي الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من القائمة 1 و 2. لهندسة الأنسجة سفن جديدة أو تصميم العلاجات عائية القائمة على فهم أهمية ديناميات الخلوية العاملة في الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية. ومع ذلك، فإن هذه العملية معقدة. يمكن أن تختلف في مواقع محددة داخل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة ويشمل أنواع خلايا متعددة (أي الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، pericytes، الضامة، والخلايا الجذعية) وأنظمة متعددة (شبكات اللمفاوية والشبكات العصبية). على الرغم من أن في المختبر نماذج ساهمت الى حد كبير في دراسة العلاقة بين الخلايا المختلفة المشاركة في الأوعية الدموية 3، يمكن أن تقوض أهميتها الفسيولوجية بسبب thei<html> ص تعقيد محدود، وحقيقة أنها لا تعكس بشكل وثيق سيناريو في الجسم الحي. للتغلب على هذه القيود، ونظم ثقافة ثلاثية الأبعاد 3، المجراة سابقا نماذج الأنسجة 4، أنظمة الموائع الدقيقة 5 و 6 و 7 النماذج الحسابية تم تطويرها وتقديمها في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة لنموذج مع القدرة على مرور الزمن لتحقيق الأوعية الدموية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة سليمة خارج الحي. وإنشاء نماذج الوقت الفاصل جديدة للدراسات الأوعية الدموية مع هذا المستوى من التعقيد توفر أداة لا تقدر بثمن لفهم الآليات الكامنة وراء تنظيم الأوعية الدموية وتحسين العلاجات. نموذج محتمل تمكن التحقيق المجراة سابقا من الأوعية الدموية عبر شبكة الاوعية الدموية الدقيقة سليمة والفئران نموذج الثقافة مساريق&gt; 8. في الأعمال الأخيرة، لقد أثبتنا أن الدم وشبكات الاوعية الدموية الدقيقة اللمفاوية تبقى قابلة للحياة بعد الثقافة. الأهم من ذلك، نموذج ثقافة مساريق الفئران يمكن استخدامها لتحقيق الوظيفية التفاعلات خلية حوطية البطانية الخلايا والدم وصلات الخلايا البطانية اللمفاوية، والوقت الفاصل بين التصوير. الهدف من هذه الورقة هو تقديم لدينا بروتوكول للأسلوب التصوير في الوقت الفاصل بين. وثيقتنا نتائج ممثل أنواع الخلايا المتعددة التي تبقى قابلة للحياة بعد تحفيز الأوعية الدموية مع الدم وتقديم أمثلة على استخدام هذا الأسلوب لتحديد كمية الأنسجة ردود عائية محددة وكذلك البطانية دراسات تتبع الخلية.

<table><tbody><tr><td>ثنى</td><td>الكاردينال هيلث</td><td>4012</td><td>12 × 12 بوصة Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td></tr><tr><td>مقبض مشرط</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-9843</td><td>مقبض مشرط ، # 3 ؛ صلب; 4 "طول</td></tr><tr><td>شفرة جراحية معقمة</td><td>سينسيناتي الجراحية</td><td>0110</td><td>الفولاذ المقاوم للصدأ. مقاس 10</td></tr><tr><td>صحن ثقافة (60 مم)</td> <td>130181</td> <td>حراري علمي</td><td>10 / كم</td></tr><tr><td>ملقط Graefe (ملاقط منحنية) أداة</td> <td>جراحية Roboz</td><td>RS-5135</td><td>ملقط تشريح دقيق ؛ مسنن; منحنى طفيف عرض الطرف 0.8 مم ؛ 4 "طول</td></tr><tr><td>Graefe ملقط (ملاقط مستقيمة) Roboz</td> <td>أداة جراحية</td><td>RS-5130</td><td>ملقط تشريح دقيق ؛ مسنن ، مستقيم. عرض الطرف 0.8 مم ؛ 4 "طول</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz أداة جراحية</td><td>RS-5677</td><td>Noyes مقص زنبركي مايكرو تشريح ؛ مستقيمة ، نقاط حادة حادة ؛ 13 مم حافة القطع ؛ 0.25 مم عرض الطرف ، 4 1/2 "</td></tr><tr><td>وسادات شاش</td> ذات الطول <td>الكلي FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>إسفنج شاش قطني غير معقم ؛ 4 "× 4" 12 رقائق</td></tr><tr><td>من القطن المقووى</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6 "الطول ؛ رمح خشبي استخدام واحد فقط</td></tr><tr><td>6 آبار لوحة</td><td>فيشر Scientific</td><td>08-772-49</td><td>قاع مسطح مع غطاء تبخر منخفض ؛ البوليستيرين; </td></tr><tr><td>حقنة معقمة</td> غير حرارية 5 مل <td>فيشر ساينتفيك</td><td>14-829-45</td><td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Sterile Bowl</td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 أونصة كيس قشر. أزرق; </td></tr> إدراج لوحة معقمة ذات <tr><td>6 آبار للاستخدام الفردي (إدراج CellCrown) إدراج</td> <td>لوحة SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>6 آبار ؛ </td></tr><tr><td>غشاء مرشح البولي</td> غير المعقم <td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>مرشح غشاء Isopore ؛ البولي; ماء; 5.0&nbsp; ومايكرو. م ، 47 &nbsp ؛ مم ، أبيض عادي</td></tr> <tr><td><قوي > الاسم < / قوي ></td> <td><قوي > شركة < / قوي ></td> <td>< قوي > رقم الكتالوج </td> <td> التعليقات / الوصف </td></tr> <tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (طلب من MWI Veterinary Supply)</td> <td>MWI #: 011168</td><td>العنصر النشط: لكل 100 مل ، 390 مجم صوديوم بنتوباربيتال ، 50 مجم فينيتوين صوديوم &nbsp ؛</td></tr><tr><td>كيتامين</td><td>فورت دودج لصحة (مطلوب من MWI Veterinary Supply)</td> <td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 مجم / مل</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (مطلوب من MWI Veterinary Supply)</td> <td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg /</td></tr><tr><td>mL Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>كحول الأيزوبروبيل</td><td>فيشر Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>بوفيدون اليود</td><td>المعامل</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>فيشر العلمي</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>فيشر العلمي</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>مترافق FITC ليكتين</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 شوندروتن كبريتات البروتيوغليكان الأجسام المضادة</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) الجسم المضاد</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 الأجسام المضادة</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب Cy2 الأجسام المضادة المترافقة</td><td>جاكسون ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للفأر Cy3 المترافق الجسم المضاد</td><td>جاكسون ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>ستربتافيدين Cy3 الأجسام المضادة المترافقة</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>طقم البقاء / السمية الخلوية الحي / الميت</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز العادي&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>فأر أحادي النسيلة مضاد للبرومودوكسيوريدين&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; استنساخ Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>ماوس مضاد للفئران CD11b&nbsp;</td><td>عبد الديمقراطي سيروتيك</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

الأوعية الدموية، الذي يعرف بأنه نمو أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة من قبل، ينطوي على الخلايا البطانية، pericytes، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا المناعية، والتنسيق مع الأوعية اللمفاوية والأعصاب. الخلية متعددة، والتفاعلات المتعددة نظام تستلزم التحقيق في الأوعية الدموية في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وهكذا، في حين أن استخدام في المختبر نماذج لزراعة الخلايا قدمت رؤى الآلية، نقد شيوعا هو أنها لا ألخص التعقيدات المرتبطة مع شبكة الاوعية الدموية الدقيقة. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات القدرة على إجراء مقارنات الوقت الفاصل بين شبكات الاوعية الدموية الدقيقة على حالها قبل وبعد تحفيز الأوعية الدموية في أنسجة الفئران مساريق مثقف. الأنسجة مثقف تحتوي على شبكات الاوعية الدموية الدقيقة التي تحافظ على التسلسل الهرمي بهم. وضع العلامات المناعى يؤكد وجود خلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العضلية الملساء، pericytes والأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية. فيddition، واصفة الأنسجة مع BSI-كتين يمكن مقارنة الوقت الفاصل بين المناطق الشبكة المحلية قبل وبعد التحفيز مصل أو عامل النمو يتسم بزيادة تنتشر الشعرية وكثافة السفينة. في مقارنة لنماذج ثقافة الخلية المشتركة، وهذه الطريقة توفر أداة لدراسات الخلايا البطانية النسب والأنسجة التقييم المحددة المخدرات عائية في شبكات الاوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

بعد 3 أيام في الثقافة، وصفت الأنسجة مع الميتة عدة الحية / الجدوى / السمية الخلوية لإثبات جدوى من الأوعية الدموية الدقيقة في نموذج الثقافة الفئران مساريق (الشكل 2A). بقيت غالبية الخلايا الموجودة في مساريق قابلة للحياة في الثقافة حيث تم تحديد القائمة على الخلايا البطانية على مواقعها في قطاعات الاوعية الدموية الدقيقة. وأكد تكاثر الخلايا البطانية أيضا كتين / BrdU وضع العلامات (الشكل 2D). وأكد الخلايا العضلية الملساء وج...

يتضمن تكوين الأوعية الدموية تفاعلات متعددة الخلايا ومتعددة الأنظمة تحتاج إلى التحقيق في بيئة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. الهدف من هذه الدراسة هو إظهار قدرة نموذج ثقافة المساريق للفئران على إجراء مقارنات بفاصل زمني لشبكات الأوعية الدموية الدقيقة السليمة أثناء تكوين الأوعية.

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

الهدف العام من هذه التجربة هو توضيح استخدام نموذج زراعة المساريق لدى الجرذ للتحقيق عبر تقنية التصوير الزمني (time-lapse) في إعادة تشكيل الشبكة الوعائية الدقيقة خارج الجسم الحي (ex vivo)، وذلك لتقييم التفاعلات بين الطفيليات والخلايا البطانية، أو الروابط بين الخلايا البطانية الدموية واللمفاوية، أو تأثيرات الأدوية المضادة لتكون الأوعية الدموية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إعادة تشكيل الأوعية الدقيقة، بما في ذلك كيفية معرفة الأوعية الدقيقة لمكان النمو، ومصير قطع الخلايا البطانية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تصوير شبكات وعائية دقيقة حقيقية وسليمة قبل النمو خارج الجسم الحي وبعده.سيقوم Sadegh Azimi، وهو طالب دراسات عليا في مختبرنا ومطور هذه الطريقة، بشرح الإجراء. ابدأ بوضع منصة من البلكسي جلاس المعقمة بالإيثانول فوق وسادة امتصاص معقمة، ثم ضع جرذًا ذكرًا بالغًا ومخدرًا فوق المنصة. قم بتطهير منطقة البطن المحلوقة للجرذ باستخدام منديلين مبللين بكحول isopropyl بتركيز 70%، يليهما povidone-iodine.بدءًا من نقطة تبعد بوصة واحدة أسفل عظم القص، استخدم مشرطًا لإجراء شق في الأمعاء يتراوح طوله بين ثلاثة أرباع البوصة وبوصة وربع، وذلك عبر الجلد والأنسجة الضامة والعضلات. بعد ذلك، ضع غطاءً جراحيًا به فتحة مقصوصة مسبقًا فوق الحيوان، ثم ضع منصة جراحية فوق الغطاء، مع الحرص على محاذاة الفتحات في كلتا المادتين مع موقع الشق. وباستخدام مسحات قطنية معقمة، اسحب اللفائفي عبر فتحة المنصة الجراحية مع سحب ست إلى ثماني نوافذ مساريقية.استخدم حقنة معقمة لتقطير محلول ملحي معقم بدرجة حرارة 37 درجة مئوية على الأنسجة المكشوفة حسب الحاجة. وعندما يتم إخراج جميع النوافذ، استخدم الملاقط للإمساك بكتلة دهنية واستخدم المقص لاستئصال النوافذ، مع ترك حافة دهنية بعرض 2 ملم حول كل نسيج مساريقي. احرص على ألا تلمس الملاقط النوافذ المساريقية من خلال لمس الحواف الدهنية المحيطة بها فقط.اغسل كل نافذة مرة واحدة في محلول PBS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ومرة واحدة في الوسط الغذائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية فور جمعه. أعد اللفائفي إلى التجويف البطني بعد عزل جميع النوافذ. في غطاء تدفق صفائحي معقم، استخدم الملاقط لنقل كل نسيج مساريقي من الحافة الدهنية إلى غشاء ترشيح البولي كربونات الخاص بقطعة إدراج طبق زراعة الخلايا.استخدم وسادة الدهون لفرد عينات الأنسجة بسرعة، مع الحرص على عدم لمس النوافذ. بعد ذلك، اقلب القطعة الملحقة وضعها في بئر واحدة من طبق بستة آبار بحيث تستقر الأنسجة بشكل مسطح في قاع البئر. غطِّ الأنسجة بـ 3 mm من الوسط الغذائي، وانقل النوافذ المتبقية إلى الطبق بنفس الطريقة.بعد ذلك، يتم استزراع نوافذ المساريق تحت ظروف حاضنة استزراع الأنسجة القياسية لمدة تصل إلى خمسة أيام. وفي يوم التصوير، تُضاف مادة BSI lectin المقترنة إلى المزارع وتُعاد الطبقة إلى الحاضنة. وبعد 30 دقيقة، تُغسل العينات مرتين بوسط خالٍ من الـ lectin، ثم تُنقل الطبقة إلى منصة المجهر الفلوري.حدد الأوعية الدموية واللمفاوية بناءً على شكلها وبنية شبكاتها. بعد ذلك، حدد منطقة اهتمام شبكية في كل نسيج للحصول على الصور، مع تدوين الموقع لضمان التقاط المنطقة نفسها في الصور اللاحقة. وعند الانتهاء من الحصول على جميع الصور، أعد العينات إلى الحاضنة حتى جلسة التصوير التالية أو نقطة النهاية التجريبية المناسبة.بعد ثلاثة أيام من الزرع، تكون غالبية الخلايا الموجودة في المساريق حيوية، وقد تم تأكيد وجود الخلايا البطانية من خلال موقعها في القطع الوعائية الدقيقة. كما يمكن تأكيد تكاثر الخلايا البطانية عن طريق وسم lectin/BrdU، بينما يمكن تأكيد وجود خلايا العضلات الملساء والطفيليات على طول الأوعية باستخدام وسم NG2. ويؤكد وسم الشبكة الوعائية الدقيقة اللمفاوية والدموية المتفرعة الحفاظ على النمط الظاهري للخلايا اللمفاوية في النسيج المزروع.يؤدي تدعيم وسط زراعة أنسجة نافذة المساريق بـ 10% serum لمدة ثلاثة أيام إلى تحفيز استجابة وعائية قوية، حيث يتم تحديد قطع وعائية جديدة وبراعم شعيرية بعد خمسة أيام من التحفيز. ويسمح التصوير بفاصل زمني (Time lapse imaging) بقياس عدد الأوعية لكل منطقة وعائية وعدد البراعم الشعيرية لكل منطقة وعائية من خلال صورة واحدة بمكبر 4x لكل نسيج. كما تتيح المقارنات بفاصل زمني لمناطق الشبكة تتبع قطع الخلايا البطانية وتحديد الأنماط غير الصحيحة للأوعية الدموية واللمفاوية.علاوة على ذلك، يؤكد وسم الليكتين وCd11b وجود البلاعم المقيمة الخلالية في شبكات إعادة التشكيل. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ينبغي أن يكون من الممكن إكمالها في أقل من أربع ساعات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية حصاد وزراعة وتصوير أنسجة المساريق لدى الجرذان باستخدام التصوير بالفاصل الزمني.

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

ويقدم طريقة جديدة لمراقبة تنوعا من دوران الأوعية الدقيقة. فهو يعتبر مناسبة للمراقبة على المدى الطويل ، وعلى تركيبة مع التدخلات البيولوجية pharmacophysiological أو الجزيئي.

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

لم تكن طبيعية نسيج أوعية دموية الكبار الثدييات التي تفتقر الأوعية الدموية الفسيولوجية والتي تتعرض لتدخل جراحي يستخدم لدراسة : (ط) بدء وتطوير الأوعية الدموية داخل الصفاق التالية من وكلاء الإدارة الاختبار ، و (ب) تعديل الأوعية الدموية التالية للادارة الشاملة اختيار وكلاء الاختبار.

الفئران الفحص مساريق الأوعية الدموية

توضح هذه المقالة نموذج بسيط لتحفيز الأوعية الدموية في مساريق الفئران. نموذج تنتج زيادات هائلة في مجال الشعرية، التي تنتشر الأوعية الدموية والأوعية الدموية أكثر كثافة دورة زمنية قصيرة نسبيا في الأنسجة التي تسمح EN تصور وجه من شبكات الاوعية الدموية الدقيقة كله وصولا الى مستوى خلية واحدة.

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

وظيفة الخلايا الوعائيةتعتمد على نشاط الرسل داخل الخلايا.  الموصوفة هنا هي طريقة تصوير الفوتون خارج الجسم الحي تسمح بقياس مستويات الكالسيوم وأكسيد النيتريك داخل الخلايا استجابة للمنبهات الفسيولوجية والدوائية في خلايا البطانية والعضلات الملساء الفردية في الشريان الأورطي المعزول.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

تتيح تقنية Landis المعدلة القياس المزدوج للتوصيل الهيدروليكي للأوعية الدقيقة الفردية في المساريق للفئران العادية والمعدل وراثيا تحت ظروف التحكم والاختبار باستخدام تقنيات التروية الدقيقة. يوفر طريقة ملائمة لتقييم الآليات التي تنظم نفاذية الأوعية الدقيقة والتبادل عبر الأوعية الدموية في ظل الظروف الفسيولوجية.

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

نقوم بتفصيل بروتوكول لمراقبة سلوك العدلات والخلايا الوحيدة في الأوردة المساريقية في ظل الحالة المستقرة والظروف الالتهابية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر داخل الحيوية على الفئران المخدرة.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

ويصف هذا البروتوكول التصوير إينترافيتال من الفئران المحورة وراثيا معربا عن علامات نيون خلية على حدة. تصوير إينترافيتال يوفر طريقة غير الغازية للملاحظات ذات الدقة العالية في الحيوانات الحية باستخدام windows القابلة للغرس الممكن التصور مجهرية من العمليات من خلالها. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص دراسة العمليات الطولية.

إينترافيتال المجهري لاستخدام المفرج المرتبطة بورم متقدم الظهرية Skinfold الدوائر النافذة في الفئران المعدلة وراثيا نيون

ويصف هذه المخطوطة في المختبر بروتوكولات الفحص المجهري الفيديو لتقييم وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين الدماغية مقاومة الفئران. ويصف المخطوط أيضا تقنيات لتقييم كثافة ميكروفيسيل مع فلوريسسينتلي المسمى نضح يكتين والأنسجة باستخدام الليزر دوبلر Flowmetry.

تقييم آليات مراقبة الأوعية الدموية استخدام الفحص المجهري الفيديو الشرايين المقاومة المعزولة من الفئران

هنا هو بروتوكول لدراسة الأوعية الدقيقة التاجية في أنسجة القلب المورين الحية عن طريق مراقبة الجسم الحي السابق لضغط الأوعية الدموية وتدفق الشرايين التي تحافظ على الضغط ، وكذلك مكونات شجرة الأوعية الدموية بما في ذلك أسرة الشعيرات الدموية و pericytes ، كما يتم رص الشريان الحاجز وضغط.

دينامية القياس والتصوير من الشعيرات الدموية، والشريين، و Pericytes في قلب الماوس

في البروتوكول الحالي ، تم تقييم وظيفة الحاجز البطاني للغدة تحت الفك السفلي (SMG) عن طريق حقن مقتفيات فلورية مختلفة مرجحة جزيئيا في الأوردة الزاوية لنماذج الاختبار في الجسم الحي تحت مجهر المسح بالليزر ثنائي الفوتون.

في الجسم الحي كشف نفاذية الأوعية الدموية في الغدة تحت الفك السفلي للفأر

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتحفيز إصابة نقص تروية المساريق وإعادة التروية وتصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) في الأوردة المساريقية باستخدام الفحص المجهري داخل الحيوية. تم تقييد تدفق الدم في الشريان المساريقي العلوي لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بإعادة التروية ، مما يسمح بالقياس الكمي المباشر للتصاق الكريات البيض و NETosis.

تصور مصائد العدلات خارج الخلية في الأوردة المساريقية بعد إصابة نقص التروية المساريقية وإعادة التروية عبر الفحص المجهري داخل الحيوية

اكتشف نموذج زراعة مساري الجرذ لتصوير شبكات الأوعية الدقيقة بالتصوير الزمني. تتيح هذه الطريقة دراسة تفاعلات الخلايا البطانية وتأثيرات الأدوية المضادة للأوعية في بيئة فسيولوجية.

ل

استكشف المزيد من الفيديوهات