وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

الهدف العام من هذه الطريقة البسيطة هو إنشاء خطوط الخلايا الأرومية الليمفاوية B ، أو B-LCLs ذات كفاءة عالية في الخلود باستخدام كمية صغيرة فقط من الدم وتوفير الوقت بين البدء والحفظ بالتبريد. هذه طريقة جديدة لتخليد الخلايا البائية البشرية من الدم الكامل عن طريق تحلل خلايا الدم الحمراء. توفر B-LCLs مصدرا قيما للمواد الحيوية لإجراء دراسات مختلفة.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن 0.5 مل فقط من الدم يكفي للحصول على B-LCLs بكفاءة الخلود وقابلية عالية للخلية. لإنشاء B-LCLs بواسطة فيروس Epstein-Barr ، أو EBV ، وتحويل الخلايا الليمفاوية البائية ، الطريقة المستخدمة على نطاق واسع إلى خلايا أحادية النواة للدم المحيطي منفصلة أو PBMC ، عن طريق الطرد المركزي المتدرج بكثافة Ficoll. ومع ذلك ، عندما تكون العينة أقل من ملليلتر واحد من تحلل خلايا الدم الحمراء ، ستفشل الإضافة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كان من الصعب عزل PBMC عن خلايا الدم الحمراء الصغيرة باستخدام طريقة فصل تدرج الكثافة. لتحضير EBV ، ابدأ في اليوم الأول بإذابة خلايا B95-8 وزراعتها في قارورة مزرعة T25 في ستة ملليلتر من RPMI 1640 Medium الكامل المكمل بنسبة 10٪ FBS ، ومليمولار من L-glutamine ، والمضادات الحيوية. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم الثاني ، تحت المجهر ، راقب مورفولوجيا الخلية. تكون الخلايا في حالة جيدة عندما تكون مشرقة ومستديرة. أضف 10 مل من RPMI 1640 Medium الكامل إلى الثقافة.

في اليوم الرابع ، أضف 10 مل من الوسط الطازج وانقل الخلايا إلى قارورة ثقافة T75. ثم ، في اليوم الثامن ، أضف 20 مل من الوسط وحافظ على الخلايا لمدة ثمانية أيام دون إضافة وسيط جديد. في اليوم 16 ، افحص الخلايا تحت المجهر.

ثم جمع 12 مل من الخلايا في أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، حافظ على الخلايا بالتبريد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة وقم بإذابة المزارع بسرعة عند 37 درجة مئوية. كرر التجميد والذوبان ثلاث مرات أخرى حتى يتم إطلاق جزيئات الفيروس من الخلايا.

الطرد المركزي الثقافات عند 240 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم قم بتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرون. اقتبس 12 مل من المرشح لكل أنبوب وتخزين الأنابيب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ، أضف 0.5 مل من الدم الكامل الذي تم مضاد للتخثر بواسطة EDTA K2. أضف ملليلترا واحدا من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الدم كله واخلطه جيدا. احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. ثم أضف بسرعة خمسة إلى سبعة ملليلتر من 1x PBS لإيقاف تفاعل التحلل.

بعد إضافة مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الدم ، تأكد من الخلط جيدا. يضمن الانعكاس إنهاء التفاعل في الوقت المناسب. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 240 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

سوف تترسب خلايا الدم البيضاء في قاع الأنبوب. تخلص من المادة الطافية واغسل الراسب بإضافة سبعة ملليلتر من 1640 Basic Medium. ثم الطرد المركزي المحلول قبل تكرار الغسيل.

مع 300 ميكرولتر من وسط التحويل ، قم بإعادة تعليق بيليه الخلية. ثم لإجراء عدوى EBV ، أضف 60 ميكرولترا من 20 ميكروغراما لكل مليلتر من السيكلوسبورين أ إلى تعليق الخلية. قم بإذابة الثلج السريع من EBV عند 37 درجة مئوية وإضافة 240 ميكرولترا من الفيروس إلى الخلايا.

امزج التعليق جيدا وانقل 200 ميكرولتر لكل بئر إلى لوحة 96 بئر. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في الشهر الأول بعد الإصابة بفيروس إب ولاي، قم بتغيير نصف الوسط في مزرعة الخلية مرة واحدة في الأسبوع.

في اليوم السابع ، لا تظهر سوى طبقة سميكة من شظايا الخلايا تحت المجهر. بعد شهر واحد من الإصابة ، تظهر مجموعات الخلايا الأرومية الليمفاوية تحت طبقة سميكة من شظايا الخلايا. من هذه النقطة فصاعدا ، قم بتغيير نصف الوسط كل ثلاثة أيام حتى تظهر مجموعات الخلايا بوضوح تحت المجهر.

بعد تعليق الخلايا ، انقل التعليق إلى آبار لوحة 24 بئر. ثم اعتمادا على معدل نمو الخلايا ، عندما يتحول وسط الثقافة إلى اللون الأصفر ، ضاعف حجم RPMI 1640 Medium الكامل. عندما تكون مجموعات الخلايا الأرومية الليمفاوية مرئية للعين المجردة ، انقل المزرعة إلى قارورة ثقافة T25.

عندما يتحول وسط الثقافة إلى اللون الأصفر ، ضاعف حجم الوسط حتى يتسع الحجم إلى 10 إلى 15 مل. قبل التجميد ، قم بتغيير الوسط قبل 24 ساعة. ثم لتجميد الخلايا ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية واستخدم عداد الخلايا لحساب الخلايا.

مع محلول المخزون المجمد الذي يحتوي على 90٪ FBS و 10٪ DMSO ، اضبط التعليق على كثافة من خمسة إلى 10 مرات 10 في الخلايا السادسة لكل مليلتر. ثم قم بتجميد المعلق بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل نقل الخلايا المجمدة مباشرة إلى النيتروجين السائل. أثناء عملية التحول ، تكون التغيرات المورفولوجية للخلايا مرئية عن طريق الفحص المجهري الضوئي.

بعد سبعة أيام من الإصابة ، تظهر مجموعات صغيرة من الخلايا بوضوح باستخدام طريقة فصل تدرج الكثافة ، بينما يمكن رؤية طبقة سميكة فقط من شظايا الخلايا من طريقة تحلل خلايا الدم الحمراء. بعد 30 يوما من الإصابة ، تظهر مجموعات الخلايا الأرومية الليمفاوية تحت الطبقة السميكة من شظايا الخلايا. مع التغيرات المتوسطة الأكثر تواترا ، يتم تقليل حطام الخلية وتكون مجموعات الخلايا مرئية بوضوح وتبدو مشابهة للثقافة التي تم إنشاؤها بواسطة فصل تدرج الكثافة.

أخيرا ، تم استخدام مقايسة MTT لتقييم جدوى B-LCLS. تشير النتائج الموضحة هنا إلى أن خلايا B-LCLs المزروعة باستخدام طريقة تحلل الدم الأحمر كانت أكثر قابلية للحياة بشكل ملحوظ من المزرعة التي تم إنشاؤها باستخدام طريقة فصل تدرج الكثافة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء عملية التحول الفيروسي EBV في 30 دقيقة عندما يتم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء B-LCLs باستخدام طريقة تحلل خلايا الدم الحمراء البسيطة والموفرة للوقت دون تنقية سابقة للخلايا الليمفاوية. بعد تطويرها ، أدت هذه التقنية إلى تسريع تقدم دراسة علم الجينوم والنسخ والبروتينات للأمراض المرتبطة ب EBV وهذا التطبيق في إنتاج الأجسام المضادة أحادية النواة. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض البشرية ، مثل EBV ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.