وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

الهدف العام من هذه الطريقة هو توجيه تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات نحو البرنامج البدائي أو النهائي لكونة الدم باستخدام نهج معالجة الإشارة الخاص بالمرحلة. يمكن أن تعالج هذه الطريقة العديد من الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل فهم منظمات الإشارة والنسخ لتكون الدم البشري النهائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم معالجة خاصة بالمرحلة على الفور.

يوضح هذا الإجراء كاريسا ديجي ، ما بعد الدكتوراه في مختبري. لبدء البروتوكول ، احصل على خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المعدة مسبقا أو HPSCs المزروعة على الخلايا الليفية الجنينية للفأر أو MEFs إلى 70٪ إلى 80٪ في حاضنة 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون.

بعد دقيقة واحدة ، قم بشفط التربسين وأضف ملليلترا واحدا من وسائط المخزون إلى كل بئر. باستخدام مكشطة الخلية ، اكشط الخلايا من اللوحة. ثم أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل إلى كل بئر.

باستخدام ماصة مصلية سعة ملليلتر، قم بتقطيع الخلايا ثلاث إلى خمس مرات لتفتيت الكتل الكبيرة. ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي HPSCs عند 330 × G لمدة خمس دقائق.

بعد الدوران ، أضف وسائط HPSC وأعد تعليق الخلايا. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من HPSCs المعاد تعليقها إلى كل بئر من الأواني البلاستيكية المشفرة ب MAT واحتضان الخلايا طوال الليل. بعد 24 ساعة ، قم بسحب الوسائط واستبدلها ب 37 درجة مئوية 0.05٪ Trypsin EDTA لمدة دقيقة واحدة.

استنشاق التربسين EDTA. أضف وسائط مخزون واحدة من المليلتر واكشط الخلايا بقوة باستخدام مكشطة الخلية. ثم أضف ملليلتر واحد من وسائط الغسيل.

باستخدام ماصة مصلية سعة ملليلتر ، قم بتقطيع الخلايا ثلاث مرات ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا عند 220 × جم لمدة خمس دقائق. ثم استنشق الوسائط ، وأضف 20 مل من وسائط الغسيل واستخدم ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر لإعادة تعليق الخلايا برفق.

بعد الطرد المركزي والشفط ، أعد تعليق الأجسام الجنينية أو EBs بعناية في وسائط Day Zero. قم بتوزيع ملليلترين من وسائط التمايز التي تحتوي على EBs في كل بئر من طبق زراعة الخلايا منخفض الالتصاق بستة آبار باستخدام ماصة مصلية سعة عشرة ملليلتر. ضع EBs في حاضنة غازات متعددة الغازات بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون وخمسة بالمائة من O2.

بعد أربع وعشرين ساعة ، أضف ملليلترين من وسائط اليوم الأول. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة متعددة الغازات. بعد 18 ساعة ، قم بحصاد EBs برفق باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة خمس دقائق.

اغسل وامزج المزرعة بأكملها مع عشرة ملليلتر من Dulbecco Medium المعدل من Iscove أو IMDM. بعد تدوير المزرعة مرة أخرى عند 100 × جم لمدة خمس دقائق لإزالة الحطام ، قم بسحب الوسائط. أعد تعليق EBs برفق باستخدام Day Two Media باستخدام ماصة P1000.

ثم قم بتوزيع ملليلترين من EBs لكل بئر في ألواح زراعة الخلايا منخفضة الالتصاق بستة آبار. أضف ثلاثة CHIR99021 ميكرومولار أو IWP2 لتحديد أسلاف الدم النهائية أو البدائية على التوالي. احتضان اللوحة في حاضنة غازات متعددة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 ساعة.

بعد 30 ساعة ، اعزل EBs بماصة مصلية سعة ملليلتر عن طريق نقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وتحريكها عند 330 × جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق EBs برفق واغسلها ب 10 مل من IMDM. أعد تعليق EBs في Day Three Media وقم بتوزيع ملليلترين في كل بئر من الألواح الستة الآبار منخفضة الالتصاق.

احتضان الخلايا في حاضنة متعددة الغازات بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. بعد 72 ساعة من الحضانة ، أضف ملليلترين من Day Sixth Media إلى كل بئر. ثم احتضان EBs في حاضنة متعددة الغازات بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة إضافية.

اعزل EBs المعالجة CHIR99021 في اليوم الثامن من التمايز وانتقل إلى القسم التالي. جهاز الطرد المركزي EBs عند 330 × G لمدة خمس دقائق. شفط المادة الطافية.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من 0.25٪ Trypsin EDTA إلى EBs. قم بدوامة EBs لمدة خمس ثوان واحتضان Ebs في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثماني دقائق. ثم أضف خمسة ملليلتر من محلول التوقف وقم بالطرد المركزي EBs.

ثم استنشق المادة الطافية. أعد تعليق EBs في خمسة ملليلتر من Collagenase II.Vortex الأنبوب لمدة خمس ثوان ثم احتضان EBs في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد 60 دقيقة ، قم بتدوير EBs لمدة خمس ثوان وأضف خمسة ملليلتر من محلول التوقف.

بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من محلول FACS. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون لإزالة كتل الخلايا غير المنفصلة. المضي قدما في وضع العلامات على الأجسام المضادة وعزل FACS للأسلاف البطانية الدموية الإيجابية CD34.

بعد عزل FACS، قم بتعليق الخلايا في وسائط التعليم العالي قم بتوزيع الخلايا في حصص 50 ميكرولتر في صفيحة ثقافة منخفضة الالتصاق 96 بئرا ثم احتضان الخلايا طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، يجب أن تتجمع أسلاف المكونة للدم في كتل من ست إلى عشر خلايا.

انقل كميات 50 ميروليتر من الخلايا المعاد تجميعها برفق إلى وسط صفيحة مشفرة ب MAT. ضع اللوحة برفق في حاضنة الغازات المتعددة لمدة أربع إلى ست ساعات حتى يتم توصيل الخلايا. بعد أربع إلى ست ساعات ، للسماح للخلايا بالالتصاق ، أضف ببطء ملليلترا واحدا من وسائط HE المعدة حديثا إلى كل بئر.

احتضان الخلايا في حاضنة الغازات المتعددة حتى تظهر الخلايا الدموية. بعد ذلك ، قم بحصاد أسلاف الدم النهائي عن طريق إزالة وسائط HE برفق من الخلايا والمرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرون لجمع التدفق. بالنسبة للخلايا الملتصقة المتبقية ، أضف 0.5 مل 0.25٪ Trypsin EDTA إلى الخلايا واحتضانها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد التربسين ، أضف 0.5 مل من محلول التوقف إلى كل بئر. مرر الخلايا عبر نفس مصفاة الخلايا 40 ميكرون لتجميع جميع الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة معا وتدوير الخلايا. أضف 2,000 إلى 10,000 خلية معزولة FACS إلى بئر واحد من خلايا OP9 DL4 في وسائط OP9.

احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. لتمرير الخلايا كل أربعة إلى خمسة أيام ، قم بتقطيع الخلايا بماصة سعة مليلتر واحد. تمر عبر مرشح 40 ميكرون لإزالة التكتلات.

بعد الطرد المركزي ، استنشق الوسائط. أعد تعليق الخلايا في ملليلترين من وسائط الخلايا التائية الطازجة وضعها على خلايا OP9 DL4 الجديدة. بعد 21 يوما على الأقل من الثقافة الباردة ، قم بتقطيع الخلايا بقوة وقم بالمرور عبر مرشح 40 ميكرون لإزالة بقايا الخلية.

جهاز طرد مركزي عند 330 × جم لمدة خمس دقائق وشفط المادة الطافية ثم استمر في قياس التدفق الخلوي القياسي. يظهر قياس التدفق الخلوي أن ثقافات التمايز المعالجة ب IWP2 ، تنتج مجموعة مميزة إيجابية CD34 و CD43 سلبية و CD34 منخفضة CD43 إيجابية. في حين أن ثقافات التمايز المعالجة ب CHIR تحتوي على أقل من 1٪ خلايا إيجابية CD43 في اليوم الثامن من التمايز.

ستؤدي الأسلاف المكونة للدم البدائية المشتقة في ظل ظروف IWP2 المعزولة في اليوم التاسع إلى ظهور أسلاف كريمة كريمة ونخاعية بدائية في الغالب في فحوصات ميثيل السليلوز. المجموعة السلبية CD34 CD43 الإيجابية المشتقة من العلاج CHIR99021 هي مجموعة غير متجانسة تحتوي على أسلاف بطانية بالإضافة إلى CD34 إيجابي ، CD43 سلبي ، CD73 سلبي ، CD184 بطانة الدم السلبية CD184 ، والتي عند عزلها بواسطة FACS ستشكل في البداية طبقة أحادية من الخلايا الشبيهة بالبطانية التي تخضع بعد ذلك لانتقال بطاني إلى مكونة للدم مما يؤدي إلى مستدير ، الخلايا المكونة للدم غير الملتصقة. يمكن تقييم هذه الخلايا المكونة للدم عن طريق قياس التدفق الخلوي للتعبير عن CD34 و CD45.

يمكن استخدام أسلاف المكونة للدم المعزولة من فحوصات EHT في فحوصات ميثيل السليلوز وتؤدي إلى وحدات تشكيل مستعمرة كريمة كبيرة تشبه الانفجار ، ووحدات تشكيل مستعمرة الكريات الحمراء الصغيرة وأسلاف النخاعي. تظهر تحليلات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لإمكانات فحوصات الخلايا الليمفاوية التائية من CD34 المشتقة من CHIR99021 ، و CD43 السلبي ، و CD73 السلبي ، و CD184 السلبية المكونة للدم ، و CD34 المشتقة من IWP2 ، والسلبية CD43 السلبية ، تظهر أسلاف المكونة للدم CD45 إيجابية ، و CD56 سلبية ، وإيجابية CD4 ، وإيجابية CD8 في الأسلاف المشتقة من CHIR مما يدل على إمكانات المكونة للدم داخل مجموعة CD34 الإيجابية المدخلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات نحو كمية بدائية أو نهائية من الأسلاف المكونة للدم.