ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

الهدف العام من اختبار الخلايا الليمفاوية القائم على الإزهار هو تحديد معدلات مناعية جديدة للجزيئات الصغيرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة حول آلية تنشيط الخلايا الليمفاوية وتثبيطها. الميزة الرئيسية لهذه الوظيفة المظهرية والمقايسة ، يمكن تكييفها لاكتشاف الأدوية.

سيوضح الإجراء أحمد فودة ، طالب الدراسات العليا من مختبرنا. تحت غطاء عمل معقم ، قم بتطهير فرو أنثى فأر Nurr77 GFP البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وضع على جانبه الأيمن. بعد ذلك ، قم بعمل شق في جلد وعضلات الربع العلوي الأيسر من البطن ، وحدد موقع الطحال وإزالته ، ووضع الأنسجة في وسط خلايا الطحال على الجليد.

عندما يتم جمع كل الطحال ، انقل الأنسجة إلى طبق زراعة خلية بحجم 10 سم مربع يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط خلايا الطحال الدافئ مسبقا ، واستخدم مكبس حقنة معقمة لهرس الأنسجة حتى يصبح المحلول عكرا. بعد الهرس المكثف في وسط خلايا الطحال ، قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب سعة 50 مليلتر لإزالة أي حطام ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المفردة الناتج. أعد تعليق الحبيبات في اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء ، وقم بإزالة التفاعل بخمسة ملليلتر من RPMI ، أو أي مخزن مؤقت مناسب آخر ، بعد 20 إلى 30 ثانية.

ثم اجمع الخلايا باستخدام طرد مركزي آخر ، وأعد تعليق الحبيبات في twp ملليلتر من وسط خلايا الطحال لعد الخلايا. لعزل الخلايا التائية ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI خال من المصل عند واحد في 10 إلى الخلايا السبع لكل تركيز مليلتر. انقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر ، واترك جانبا 100 ميكرولتر من خلايا الطحال لاستخدامها لاحقا لتقييم النقاء.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر لكل مليلتر من مصل الفئران العادي إلى الخلايا ، متبوعا بإضافة 50 ميكرولتر لكل مليلتر من كوكتيل الأجسام المضادة لعزل الخلايا التائية مع الخلط اللطيف. بعد 10 دقائق ، احتضان الخلايا بخرز مغناطيسي مترافق من الستربتافيدين لمدة دقيقتين ونصف. بعد ذلك ، أضف وسيطا خاليا من المصل إلى الخلايا للحصول على حجم نهائي يبلغ ملليلترين ونصف ، وضع الأنبوب في مغناطيس عزل الخلية لمدة ثلاث دقائق.

في نهاية الحضانة ، أمسك الأنبوب في المغناطيس ، اسكب المادة الطافية في أنبوب بوليسترين جديد في حركة واحدة. يمكن بعد ذلك حساب الخلايا التائية. خلايا البذور التائية في صفيحة مستديرة القاع 96 بئرا بتركيز 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر تحتوي على 200 ميكرولتر من وسط خلايا الطحال الطازجة لكل بئر.

أضف الخرز المغناطيسي المؤتلف 7 و CD3 / CD28 إلى الآبار المناسبة ، وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. بعد 12 ساعة ، قم بتقطيع تعليق الخلية برفق في كل بئر لتفتيت أي مجاميع لخلايا الخرزة. ثم انقل معلقات الخلية من كل بئر إلى أنابيب بوليسترين فردية سعة خمسة ملليلتر.

عندما يتم جمع جميع الخلايا ، ضع كل أنبوب من الخلايا في مغناطيس الفصل لمدة خمس دقائق في كل مرة ، وصب المواد الطافية عندما لا يزال الأنبوب داخل المغناطيس ، في أنابيب البوليسترين الجديدة في نهاية كل حضانة. ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الكريات في وسط خلايا الطحال الطازجة في مرتين 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيزات مليلتر. لفحص الجزيئات الصغيرة عالية الإنتاجية ، قم بوضع 40 ميكرولترا من الخلايا لكل بئر في صفيحة 384 بئرا ، وقم بمعالجة الآبار المناسبة بالدواء أو السيارة المفضلة لفترة العلاج المطلوبة في حاضنة زراعة الخلايا.

قبل 30 دقيقة من تحليل GFP ، قم بتلطيخ الخلايا بالتركيز المناسب من محلول Hoechst ، وتوزيع البقعة جيدا باستخدام ماصة لطيفة. عندما يتم صبغ جميع الآبار ، قم بالطرد المركزي للألواح لجمع الخلايا في قاع الآبار ، واترك الخلايا ترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل اللوحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

ثم قم بتعيين الهدف على 40X أو أعلى. اضبط الكاميرا رقم أربعة لمصباح الأشعة فوق البنفسجية ، ثم اضبط الكاميرا رقم واحد لليزر 488. قم بتحميل اللوحة على نظام الفحص عالي المحتوى.

بعد ذلك ، قم بتعيين نظام فحص المحتوى العالي متحد البؤر الآلي لقراءة ستة إلى 10 حقول لكل بئر مع قراءتين متتابعتين لكل حقل ، عند 488 نانومتر وضوء الأشعة فوق البنفسجية. تمثل الخلايا التائية الإيجابية CD3 ما يقرب من 30٪ من طحال فأر معين ، مما يدل على تعبير GFP القاعدي بنسبة 10٪. بعد تحفيز حبة مستقبلات الخلايا التائية CD3 / CD28 ، لوحظت زيادة بمقدار خمسة إلى ستة أضعاف في النسبة المئوية لتعبير GFP.

وبالمثل ، تمثل الخلايا البائية الموجبة CD19 50 إلى 55٪ من إجمالي خلايا الطحال مع تعبير GFP القاعدي مشابه لتعبير الخلايا التائية غير المنشطة. ومن المثير للاهتمام ، أن تحفيز مستقبلات الخلايا البائية باستخدام IgG و IgM المضاد للفأر و CD40L المؤتلف ، يؤدي فقط إلى زيادة طفيفة في تعبير GFP. بعد عزل الخرزة المغناطيسية كما هو موضح للتو ، لا تزال الخلايا التائية الإيجابية CD3 المعزولة تعرض تعبيرا أساسيا ل GFP بنسبة 10٪.

ومع ذلك ، فإن تحفيز حبة CD3 / CD28 يؤدي إلى زيادة كبيرة في استجابة GFP. وبالمثل ، بعد عزل الخرزة المغناطيسية للخلية البائية ، تظهر الخلايا البائية المنشطة المنقاة تعبيرا أعلى عن GFP مقارنة بالخلايا البائية المنشطة في خلايا الطحال. في هذه التجربة التمثيلية ، كشف الفحص الأولي عالي الإنتاجية ل 4398 مركبا عن العديد من المنشطات والمثبطات لتنشيط الخلايا التائية.

لكن تعبير GFP المرصود للخلايا التائية المحفزة ، أعلى ب 20 مرة من ذلك المقاس للخلايا التائية غير المحفزة. السماح بإنشاء نافذة من منطقة العمل حيث يمكن بسهولة اكتشاف المركبات المثبطة ل GFP. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون 36 إلى 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عد الخلايا بعد كل خطوة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ELISA أو النشاف الغربي للإجابة على أي أسئلة إضافية أخرى. ستمهد هذه التقنية الطريق لاكتشاف الأدوية في التعديل المناعي للقوارض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتنشيط الخلايا التائية أو البائية المشتقة من لوحات الماوس Nurr77 GFP.