ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

الهدف العام من هذا المقايسة الليمفاوية القائمة على الفلورة هو تحديد مُعدِّلات مناعية جديدة من الجزيئات الصغيرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة حول آلية تنشيط الخلايا الليمفاوية وتثبيطها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه المقايسة والوظيفة المظهرية في إمكانية تطويعها لعمليات اكتشاف الأدوية.

سيقوم أحمد فودة، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا، باستعراض هذا الإجراء. تحت غطاء عمل معقم، قم بتطهير فراء فأرة Nurr77 GFP أنثى يتراوح عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع باستخدام 70%ethanol، ثم ضع الحيوان على جانبه الأيمن. بعد ذلك، قم بإجراء شق في الجلد وعضلات الربع العلوي الأيسر من البطن، ثم حدد موقع الطحال وقم بإزالته، وضع النسيج في وسط استخلاص الخلايا الطحالية (splenocyte medium) على الثلج.

عند الانتهاء من جمع كافة الطحاليات، انقل الأنسجة إلى طبق زراعة خلايا بمساحة 10 سنتيمتر مربع يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الطحالية المسخن مسبقاً، واستخدم مكبس حقنة معقمة لسحق الأنسجة حتى يصبح المحلول عكراً. بعد السحق المكثف في وسط زراعة الخلايا الطحالية، قم بترشيح معلق الخلايا عبر مصفاة خلايا بقطر 70 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر لإزالة أي شوائب، ثم قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا المنفردة الناتج. أعد تعليق الراسب في اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل كريات الدم الحمراء، مع إيقاف التفاعل بإضافة خمسة ملليلتر من RPMI، أو أي محلول منظم آخر مناسب، بعد مرور 20 إلى 30 ثانية.

بعد ذلك، اجمع الخلايا بعملية طرد مركزي أخرى، وأعد تعليق الراسب في 2 mL من وسط الخلايا الطحالية (splenocyte medium) لعد الخلايا. ولفصل الخلايا التائية (T cells)، قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، وأعد تعليق الراسب في وسط RPMI خالي من المصل بتركيز 1×10⁷ خلية/mL. انقل الخلايا إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 mL، واحتفظ بحصة قدرها 100 µL من الخلايا الطحالية لاستخدامها لاحقاً في تقييم النقاوة.

بعد ذلك، أضف 50 µL لكل ملليلتر من مصل الجرذ الطبيعي إلى الخلايا، يليه إضافة 50 µL لكل ملليلتر من مزيج أجسام مضادة لعزل الخلايا التائية مع المزج برفق. وبعد 10 دقائق، حضّن الخلايا مع حبيبات مغناطيسية مقترنة بالستريبتاديفيدين لمدة دقيقتين ونصف. ثم، أضف وسطاً خالياً من المصل إلى الخلايا ليصل الحجم النهائي إلى 2.5 mL، وضع الأنبوب في مغناطيس عزل الخلايا لمدة ثلاث دقائق.

في نهاية فترة الحضانة، وأثناء تثبيت الأنبوب في المغناطيس، اسكب السائل الطافي في أنبوب بوليسترين جديد بحركة واحدة. يمكن بعد ذلك عد الخلايا التائية. يتم استزراع الخلايا التائية في طبق ذي 96 بئراً ذات قاع مستدير بتركيز 2.5 × 10⁵ خلية لكل بئر، بحيث يحتوي كل بئر على 200 µL من وسط الخلايا الطحالية الطازج.

أضف إنترلوكين 7 المؤتلف وخرزات CD3/CD28 المغناطيسية إلى الآبار المناسبة، ثم ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا. وبعد مرور 12 ساعة، قم بتفتيت معلق الخلايا في كل بئر برفق عن طريق الترجِيح (trituration) لتفكيك أي تجمعات خلوية مرتبطة بالخرزات. بعد ذلك، انقل معلقات الخلايا من كل بئر إلى أنابيب بوليسترين فردية سعة 5 مل.

عندما يتم جمع كافة الخلايا، ضع كل أنبوب يحتوي على خلايا في مغناطيس الفصل لمدة خمس دقائق في المرة الواحدة، وصب السوائل الطافية بينما لا يزال الأنبوب داخل المغناطيس، في أنابيب بوليسترين جديدة في نهاية كل فترة تحضين. ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وأعد تعليق الرواسب في وسط خلايا طحالية جديد بتركيز 2 × 10⁶ خلية/ملل. وبالنسبة للفحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة، وزع 40 µL من الخلايا لكل بئر في طبق يحتوي على 384 بئراً، وعالج الآبار المناسبة بالعقار أو الناقل المختار للفترة العلاجية المطلوبة في حاضنة زراعة الخلايا.

قبل 30 دقيقة من تحليل GFP، قم بصبغ الخلايا بتركيز مناسب من محلول Hoechst، مع توزيع الصبغة جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة. وعندما يتم صبغ جميع الآبار، قم بطرد الصفائح مركزياً لتجميع الخلايا في قاع الآبار، واترك الخلايا ترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتحميل الصفيحة وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد ذلك، اضبط العدسة الشيئية على تكبير 40X أو أعلى. قم بضبط الكاميرا رقم أربعة للمصباح فوق البنفسجي UV، ثم اضبط الكاميرا رقم واحد لليزر 488. ضع اللوحة في نظام الفحص عالي المحتوى.

بعد ذلك، يتم ضبط نظام الفحص عالي المحتوى المجهري البؤري الآلي لقراءة من ستة إلى 10 حقول لكل بئر مع قراءتين متتاليتين لكل حقل، عند 488 nanometers والضوء فوق البنفسجي (UV light). تمثل الخلايا التائية الموجبة لـ CD3 حوالي 30% من طحال فأر معين، مع إظهار تعبير basal لـ GFP بنسبة 10%. وبعد تحفيز مستقبلات الخلايا التائية باستخدام خرزات CD3/CD28، يُلاحظ زيادة تتراوح بين خمسة إلى ستة أضعاف في نسبة تعبير GFP.

وبالمثل، تمثل الخلايا البائية الإيجابية لـ CD19 ما يتراوح بين 50 إلى 55% من إجمالي الخلايا الطحالية، مع تعبير أساسي لـ GFP مشابه لذلك الموجود في الخلايا التائية غير المنشطة. ومن المثير للاهتمام أن تحفيز مستقبلات الخلايا البائية باستخدام IgG وIgM المضادين للفئران وCD40L المؤتلف، يؤدي فقط إلى زيادة طفيفة في تعبير GFP. وبعد العزل باستخدام الخرز المغناطيسي كما تم توضيحه للتو، لا تزال الخلايا التائية الإيجابية لـ CD3 المعزولة تظهر تعبيراً أساسياً لـ GFP بنسبة 10%.

ومع ذلك، يؤدي التحفيز باستخدام حبيبات CD3/CD28 إلى زيادة تنظيم ملحوظة في استجابة GFP. وبالمثل، بعد عزل الخلايا البائية باستخدام الحبيبات المغناطيسية، تُظهر الخلايا البائية المنشطة المنقاة تعبيراً أعلى لـ GFP مقارنة بالخلايا البائية المنشطة في الخلايا الطحالية. وفي هذه التجربة التمثيلية، كشف الفحص الأولي عالي الإنتاجية لـ 4398 مركباً عن وجود العديد من المنشطات والمثبطات لتنشيط الخلايا التائية.

إلا أن تعبير GFP الملحوظ في الخلايا التائية المحفزة كان أعلى بـ 20 مرة من ذلك الذي تم قياسه في الخلايا التائية غير المحفزة. وهو ما يسمح بتوليد منطقة عمل (window of action zone) يمكن من خلالها الكشف عن المركبات المثبطة لـ GFP بسهولة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 36 إلى 48 ساعة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عد الخلايا بعد كل خطوة. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مقايسة ELISA أو لطخة ويسترن (western blotting) للإجابة على أي أسئلة إضافية أخرى. سيمهد هذا التكنيك الطريق لاكتشاف الأدوية الخاصة بالتعديل المناعي في القوارض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية عزل وتنشيط الخلايا التائية (T cells) أو الخلايا البائية (B cells) المشتقة من أطباق فئران Nurr77 GFP.