محلي الميدان مضان المجهر: التصوير الإشارات الخلوية في قلوب سليمة

الهدف العام من تقنية التصوير المجهري الفلوري المحلي هذا هو استخدام المجسات الجزيئية لقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، أو إمكانات الغشاء من مناطق القلب التي يصعب الوصول إليها على مستوى القلب بالكامل. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة القلب والأوعية الدموية الرئيسية المتعلقة بالسكتة القلبية ونقص التروية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن خصائص القلب يتم قياسها من الأحداث الخلوية في العضو السليم حيث تستمر الخلايا في الاقتران كهربائيا وميكانيكيا وأيضيا.

أولا ، قم بإعداد جهاز Langendorff الأفقي. قم بتحميل محلول Tyrode المحضر حديثا في المحاقن سعة 60 مليلتر ، وأضف جميع الأنابيب المرتبطة بالإعداد. بمجرد ملئها ، تخلص من جميع فقاعات الهواء.

بعد ذلك ، قم بموازنة المحلول المحمل بغاز الأكسجين النقي الذي يتم توصيله من حجر هوائي بلاستيكي مغمور. بعد ذلك ، ضع خياطة جراحية غير قابلة للامتصاص حول إبرة. سيكون هذا بمثابة قنية لرجعية القلب عند توصيله بالجهاز.

بعد ذلك ، اجمع القلب بعد حقن الهيبارين والقتل الرحيم للحيوان. أولا ، نظف الصدر بالإيثانول. العرض التوضيحي بفأر ، لكن نفس الإجراء يعمل على حصاد قلب الببغاء.

بعد ذلك ، باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق في أسفل البطن ثم قم بقص الجانبين باتجاه الرقبة. ثم اقطع الحجاب الحاجز بعناية ، وتجنب القلب. الآن ، اسحب الأنسجة المقطوعة للخلف وقم بتثبيتها لأسفل.

بعد ذلك ، قم بإزالة الرئتين والأنسجة المحيطة بها لكشف القلب. بمجرد تعريضه ، استخدم الملقط لإخراج القلب دون الضغط عليه. افصله عن عن طريق قطع الشريان الأورطي ، واترك أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي متصلا بالقلب.

بعد ذلك ، قم بتحميل القلب في قارب وزن صغير مع مليلتر واحد من محلول Tyrode. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة الدم والأنسجة الدهنية المحيطة بالقلب بسرعة باستخدام الملقط والمقص. باستخدام خياطة جراحية غير قابلة للامتصاص وإبرة ، قم بتوصيل الشريان الأورطي بالوصلة الأفقية لجهاز Langendorff.

قم بتأمين العقدة باستخدام ملاقط دقيقة. بعد ذلك ، ابدأ التروية بفتح الصمام لتحرير محلول Tyrode. نظف الأنسجة المحيطة وشفط الحطام للحفاظ على نظافة الغرفة الأفقية بينما يستقر القلب لمدة 10 دقائق.

اجعل الصبغة طازجة. بالنسبة إلى Rhod-2 AM ، أضف 20 ميكرولترا من 20٪ Pluronic و DMSO إلى عبوة الصبغة 50 ميكروغراما من الشركة المصنعة. تخلط عن طريق سحب العينات مع تجنب الفقاعات.

ثم انقل الصبغة المسالة إلى قارورة زجاجية شفافة ، وأضف ملليلتر واحد من محلول Tyrode. قم بإذابة الصبغة جيدا في هذا الخليط باستخدام 15 إلى 20 دقيقة من الصوتنة. بعد ذلك ، قم بنشر الصبغة المحضرة باستخدام مضخة تمعجية في درجة حرارة الغرفة.

أولا ، قم بتحميل الصبغة في غرفة الصبغة ، ثم قم بتثبيت جميع خطوط الأنابيب المتصلة بالمشعب ، واحتفظ بالمشابك فوق المشعب لمنع التدفق العكسي. بعد ذلك ، قم بتشغيل المضخة وأغلق على الفور الصمام ثلاثي الاتجاهات أسفل المحقنة سعة 60 مل. ضع الأنبوب الصغير المتصل بنهاية الشفط للمضخة بجوار القلب لإعادة تدوير الصبغة بعد أن يتم نفخها.

خذ إبرة قياس صغيرة واضغط عليها من خلال القمة لتخفيف الضغط. ثم اترك القلب يتخلل الصبغة لمدة 30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، من المهم جدا تقييم مستوى الصبغة حتى لا تدخل الفقاعات في الأنسجة ، مما قد يتسبب في نقص التروية وتلف الأنسجة.

بعد حشو الصبغة ، قم بإعادة دمج القلب بمحلول Tyrode. قم بإزالة المشبك فوق المشعب. افتح الصمام، ثم اترك القلب يستقر لمدة 10 دقائق.

أثناء التروية التحديثية ، املأ الغرفة الأفقية بمحلول Tyrode وقم بتشغيل وحدة Peltier لرفع درجة حرارة الحمام إلى 37 درجة مئوية. لتحضير ضوء الألياف الضوئية للتجربة ، ضع الألياف الضوئية أولا داخل ماصة سعة ملليلتر. ثم قم بتوصيل الماصة بمعالج دقيق.

استخدم المعالج الدقيق للضغط قليلا على الألياف البصرية على سطح البطين الجانبي. بعد ذلك ، قم ببرمجة مولد موجة لتوفير نبضة مربعة بعرض مللي ثانية واحدة. واضبط محفز القلب ليكون متزامنا خارجيا وتوصيله بمولد الموجة.

في كل من مخرجات المحفز ، قم بتوصيل سلك بإبرة الوخز بالإبر ملحومة في النهاية. قم بإرفاق إبرتين للوخز بالإبر بقمة القلب، على بعد حوالي ثلاثة ملليمترات. بمجرد وضع الإبر فقط ، ابدأ تشغيل المحفز ، وبالتالي تجنب الصدمات العرضية.

الآن ، لتسجيل إشارة النخابي ، اضبط تردد الاستحواذ في البرنامج على 10 كيلو هرتز. لجمع إشارة الشغاف ، اتبع نفس الإجراء ، ولكن استخدم إبرة قياس 23 لعمل ثقب في البطين الجانبي بالقرب من الحاجز. وبعد ذلك ، باستخدام معالج دقيق ، ضع الألياف البصرية الثانية في الشغاف.

للوصول إلى وظيفة transmural ، تمت مقارنة مورفولوجيا إمكانات الفعل المسجلة من الشغاف والنخابي. تم إجراء تسجيلات التألق بعد علاج القلب ب di-8-ANEPPS باستخدام تقنية CLFFM. كانت إمكانات الفعل أبطأ في الشغاف ، خاصة في المرحلة الأولى.

تم وصف مدة جهد الفعل بأنها الوقت الذي يستغرقه جهد الفعل لإعادة الاستقطاب إلى درجة معينة. عندما تم تطبيع المدد وتحويلها إلى التداخل في مرحلة الصفر ، يمكن مقارنتها. كان هناك بالفعل فرق كبير خلال المرحلة الأولى.

بعد ذلك ، تم استخدام Rhod-2 AM لمراقبة الكالسيوم داخل الخلايا. من أجل مقارنة الاختلافات الإقليمية في الكالسيوم داخل الخلايا ، تم تقييم حركية عابرة الكالسيوم. وبالمقارنة ، كان الوقت اللازم لذروة الزوال أطول بحوالي مللي ثانية في الشغاف.

بشكل عام ، كان لزبرة الكالسيوم من الشغاف حركية أبطأ بكثير من النخابي. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن استخدامها لتسجيل عابر الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات العمل في المناطق التي يصعب الوصول إليها في القلب. يجعل جزء Langendorff من الإعداد من العملي للغاية ضخ مواد كيميائية مختلفة في القلب ، وتقييم التأثيرات على خصائص القلب.