نماذج الحادة والمزمنة من ارتفاع السكر في الدم في الزرد: وهناك طريقة لتقييم تأثير ارتفاع السكر في الدم على الخلايا العصبية و بيوديستريبوتيون من راديولابيلد الجزيئات

الهدف العام من الإجراء التالي هو تقييم إعادة تشكيل الدماغ في حالات ارتفاع السكر في الدم ، ومتابعة الجزيئات المصنفة بالإشعاع في أسماك الزرد. يتميز ارتفاع السكر في الدم بتركيز مفرط من جلوكوز الدم. قد يكون ارتفاع السكر في الدم المزمن ناتجا عن حالات السكري ، ويسبب اختلالات مختلفة في الأوعية الدموية ، والتي بدورها قد تؤدي إلى مضاعفات سريرية ، مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية أو تقرحات القدم السكرية.

أيضا ، قد يؤدي ارتفاع السكر في الدم الحاد بسبب الإجهاد إلى حدوث مضاعفات نزفية في السكتة الدماغية الإقفارية. يعتبر سمك الزرد نموذجا مثيرا للاهتمام لفهم الأمراض البشرية وتأثيرها على الجهاز العصبي المركزي. هذا صحيح بشكل خاص ، بالنظر إلى أن دماغ الأسماك البالغة يظهر قدرة عصبية مكثفة ، وقدرة رائعة على آليات إصلاح الدماغ ، مقارنة بالثدييات ، لذلك ، تمثل أسماك الزرد نموذجا جيدا للتحقيق في إعادة تشكيل الدماغ ، بعد الإجهاد في ظل الظروف الحادة وارتفاع السكر في الدم.

كما يسمح بالتحقيق في التوزيع الحيوي للجزيئات ذات العلامات الراديوية والعوامل العلاجية المحتملة. أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للمجتمع الفرنسي والأوروبي لاستخدام في البحث ، ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية للتجارب على. اصطاد سمكة برفق بشبكة سمك.

ضع السمك في كمية صغيرة من مخدر ثلاثي الكنائين ، مخفف بتركيز نهائي قدره 0.02٪ في الماء. انتظر حتى تتوقف السمكة عن الحركة. قم بإزالة السمك باستخدام ماصة مقطوعة وضعه برفق على مناديل ورقية ماصة لإزالة الحد الأقصى من الماء.

قم بوزن السمك من أجل تحضير حقنة من d-glucose للحقن ، من 50 ميكرولتر من 2.5 جرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم. على سبيل المثال ، ستتلقى سمكة 0.6 جرام 50 ميكرولترا من محلول 3٪ d-glucose PBS. ضع السمكة على ظهرها وحافظ عليها بيد واحدة.

من ناحية أخرى ، أدخل إبرة المحقنة في التجويف داخل الصفاق ، وقم بحقن محلول d-glucose PBS ببطء. قم بإزالة الإبرة وأعد السمك إلى ماء السمك. افحص السمك حتى يتعافى تماما.

ما يتم قياس مستويات الجلوكوز في الدم بعد 1 1/2 ساعة. من أجل تقليد ارتفاع السكر في الدم المزمن ، قم بإعداد خزان سعة لترين من الجلوكوز ، بتركيز نهائي يبلغ 111 ملليمولار. لهذا ، قم بوزن 40 جراما من الجلوكوز ، وضعه في خزان فارغ.

املأ الخزان بلترين من ماء السمك ، وضع ما يصل إلى سبع أسماك فيه. قم بتغيير محلول الجلوكوز كل يومين ، لتجنب نمو البكتيريا أو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى. يتم الحصول على ارتفاع السكر في الدم المزمن عن طريق العلاج لمدة 14 يوما باستخدام د-الجلوكوز.

اصطاد سمكة بشبكة صيد وضعها على الجليد. غطي السمك بالثلج للقتل الرحيم السريع. خذ السمكة وامسحها لإزالة أي قطرات من الماء يمكن أن تخفف عينات الدم.

قم بإزالة العين باستخدام ملقط تشريح ، وانتظر حتى يمتلئ تجويف العين بالدم. ضع شريط اختبار على جهاز قياس السكر ، وأدخل الشريط في تجويف العين. لاحظ قيمة تركيز الجلوكوز في الدم.

لارتفاع السكر في الدم الحاد, حقن داخل الصفاق من د-الجلوكوز يؤدي إلى زيادة كبيرة في مستويات الجلوكوز في الدم, كما هو موضح, 1 1/2 ساعة بعد الحقن. بالنسبة لارتفاع السكر في الدم المزمن ، يؤدي غمر الأسماك في محلول الجلوكوز إلى زيادة كبيرة في مستويات الجلوكوز في الدم ، كما هو موضح بعد 14 يوما من العلاج. في نهاية الإجراء ، افصل الجسم عن الرأس بمقص تشريح ، وضع الرأس في 4٪ من بارافورمالدهيد ، مخفف في PBS لتجارب الكيمياء المناعية.

احتضن بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بدلا من ذلك ، يمكن استخراج الدماغ مباشرة ، وتجميده لتجارب أخرى ، مثل استخراج mRNA. في اليوم التالي ، يتم شطف الرؤوس الثابتة باستخدام PBS ، ويتم صيانتها بإبرة تحت مجهر تشريح.

تتم إزالة العين المتبقية ، ويتم فتح الجزء العلوي من الجمجمة برفق باستخدام الملقط. ثم يتم استخراج الدماغ بعناية ، ووضعه في 1x PBS. يتم تجفيف الأدمغة الثابتة تدريجيا ، في سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة ، تليها حمامين من التولوين لمدة 30 دقيقة.

ثم يتم وضع الأدمغة في شريط تضمين ، ويتم إغلاق الغطاء بعناية. ضعي الكاسيت في البارافين المذاب على حرارة 58 إلى 60 درجة مئوية. أثناء تضمين البارافين في الدماغ ، قم بتشغيل ملقط تضمين الاحترار.

ضع الكاسيت في حمام بارافين نظيف. في نهاية حمامات البارافين ، أخرج الكاسيت. صب بعض البارافين السائل في قالب.

افتح الكاسيت ، وضع الدماغ داخل البارافين المذاب في القالب. توجيه الدماغ باستخدام ملقط الاحترار. املأ القالب بالبارافين المذاب ، واتركه يتماسك على جزء التبريد من آلة التضمين.

لأسباب فنية ، يجب وضع الدماغ وفقا لمحور أمامي خلفي. بعد فك كتلة البارافين ، قم بقصها وتثبيتها على كاسيت به البارافين المذاب ، في الاتجاه الصحيح للسماح بالتقسيم المستعرض. أدخل كتلة البارافين في ذراع ميكروتوم ، وقم بقص أقسام 50 ميكرومتر ، حتى تصل إلى مستوى عينة الدماغ.

بعد ذلك ، قم بقص كتلة البارافين للحصول على أرجوحة ، واضبط سمك التقسيم على سبعة ميكرومترات. اجمع شرائط البارافين بفرشاة طلاء دقيقة ، وضعها على ورقة سوداء. قص شرائط البارافين كل ثلاثة إلى أربعة أقسام.

ضع شريحة على طبق تسخين ، وقم بتغطيتها بالماء المقطر. ضع الأقسام برفق على الماء على الشريحة ، وقم بتسخينها حتى 40 درجة مئوية. عندما تنتشر شرائط البارافين بشكل كاف ، قم بإزالة الماء بأنسجة ماصة.

تتم إزالة القطرات الأخيرة ميكانيكيا ، كما هو موضح. اترك الشريحة تجف قبل ساعتين على الأقل من إجراء الكيمياء المناعية الموصوفة في البروتوكول. بعد الكيمياء المناعية ، يتم تحليل الشرائح تحت مجهر تضلي ، أو مجهر كونفوكالي ، لدراسة تأثير ارتفاع السكر في الدم على تكاثر خلايا الدماغ.

يتم إجراء القياس الكمي لخلايا الدماغ في ثلاثة أقسام متتالية على الأقل ، أو منطقة ذات اهتمام. هنا ، تظهر الخلايا التكاثرية المقابلة للخلايا الإيجابية PCNA باللون الأخضر. كما ترون ، يؤدي ارتفاع السكر في الدم المزمن إلى انخفاض عدد الخلايا التكاثرية ، المسماة باللون الأخضر مع الأجسام المضادة PCNA ، في الدماغ البطني ، والدماغ الظهري ، وما تحت المهاد الذيلي ، حول التجويف الجانبي والخلفي.

بدلا من ذلك ، لدراسة آثار ارتفاع السكر في الدم على تكوين الخلايا العصبية الناجم عن الإصابة ، يمكن إجراء إصابة جرح طعنة في telencephalon أثناء علاج ارتفاع السكر في الدم المزمن. لهذا ، قم بتخدير سمكة معالجة لمدة سبعة أيام ، ووضعها تحت مجهر تشريح. ادفع حقنة قياس 30 عموديا عبر الجمجمة ، إلى وسط نصف الكرة الدماغية الأيمن.

بعد هذا الإجراء ، يجب إعادة الأسماك إلى حوضها للوقت المطلوب. هنا ، سمح للأسماك بالبقاء على قيد الحياة سبعة أيام في ماء d-glucose ، قبل التضحية بها. تنظم إصابة جرح الطعن في الدماغ بقوة التكاثر في نصف الكرة المصاب ، بعد سبعة أيام من الآفة.

تظهر بياناتنا أن ارتفاع السكر في الدم المزمن يؤدي إلى انخفاض كبير في عمليات شفاء الدماغ، عن طريق تقليل تكاثر الخلايا بعد إصابة الجرح في الدماغ الدماغي. يمكن أيضا استخدام أسماك الزرد لدراسة التوزيع الحيوي للجزيئات ذات العلامات الراديوية. هنا ، قررنا دراسة استقلاب الجلوكوز في كائن الزرد.

يجب تخدير الأسماك أولا ووضعها على منديل مبلل بالتخدير. ثم يتم وضع السمكة خلف نافذة حماية لاسلكية. يتم تحضير المحقنة التي تحتوي على 50 ميكرولتر من فلوروديوكسي جلوكوز.

يتم وضع السمكة على ظهرها ، ويتم حقنها داخل الصفاق ب 50 ميكرولتر من FDG عند 20 ميغا بيكريل. ثم توضع السمكة على منديل آخر مبلل بالتخدير. يتم لفها برفق ، ويتم وضعها على ذراع جهاز تصوير التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.

يتم إدخال الذراع في فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، ويتم إجراء التصوير. هنا ، يمكنك ملاحظة أن FDG لا يتم اكتشافه فقط في موقع الحقن ، ولكن أيضا في رأس السمكة ، ولا سيما في الدماغ ، وعلى طول الحبل الشوكي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقتين مختلفتين لتأسيس ارتفاع السكر في الدم الحاد والمزمن في أسماك الزرد ، ونظهر أن ارتفاع السكر في الدم يضعف تكاثر خلايا الدماغ في ظل الظروف الطبيعية والحالات الناجمة عن الإصابة.

في الختام ، يمكن استخدام أسماك الزرد كنموذج ذي صلة للتحقيق في الآثار الضارة لارتفاع السكر في الدم في الجهاز العصبي المركزي. كما يسمح بتقييم التوزيع الحيوي للجزيئات الموسومة بالإشعاع عن طريق فحص التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني.