نماذج الحادة والمزمنة من ارتفاع السكر في الدم في الزرد: وهناك طريقة لتقييم تأثير ارتفاع السكر في الدم على الخلايا العصبية و بيوديستريبوتيون من راديولابيلد الجزيئات

الهدف العام من الإجراء التالي هو تقييم إعادة تشكيل الدماغ في ظروف ارتفاع سكر الدم، وتتبع الجزيئات الملحقة بنظائر مشعة في أسماك الزيبرا. يتميز ارتفاع سكر الدم بتركيز مفرط من جلوكوز الدم. وقد يكون ارتفاع سكر الدم المزمن ناتجاً عن حالات مرض السكري، ويسبب اختلالات وعائية مختلفة، والتي قد تؤدي بدورها إلى مضاعفات سريرية، مثل احتشاء عضلة القلب، أو السكتة الدماغية، أو قرح القدم السكري.

علاوة على ذلك، قد تؤدي حالة فرط سكر الدم الحاد الناجمة عن الإجهاد إلى تعزيز المضاعفات النزفية في السكتة الدماغية الإقفارية. وتُعد أسماك zebrafish نموذجاً مثيراً للاهتمام لفهم الأمراض البشرية وتأثيرها على الجهاز العصبي المركزي. وهذا ينطبق بشكل خاص بالنظر إلى أن دماغ الأسماك البالغة يظهر قدرة عصبية تكوينية مكثفة، وقدرة فائقة على آليات إصلاح الدماغ مقارنة بالثدييات، وبناءً على ذلك، تمثل أسماك zebrafish نموذجاً جيداً لاستقصاء إعادة تشكيل الدماغ بعد الإجهاد في ظل ظروف فرط سكر الدم الحاد.

كما تتيح دراسة التوزيع الحيوي للجزيئات المحددة إشعاعيًا، والعوامل العلاجية المحتملة. وقد أجريت جميع التجارب وفقًا للإرشادات الفرنسية ومبادئ المجتمع الأوروبي التوجيهية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث، وبموافقة لجنة الأخلاقيات المحلية للتجارب على الحيوانات. اصطد سمكة برفق باستخدام شبكة صيد الأسماك.

ضع الأسماك في كمية صغيرة من مخدر التريكين، مخففاً بتركيز نهائي قدره 0.02% في الماء. انتظر حتى تتوقف الأسماك عن الحركة. أخرج السمكة باستخدام ماصة مقطوعة، وضعها برفق على ورق نشاف لامتصاص أكبر كمية ممكنة من الماء.

قم بوزن السمكة لتحضير محقنة من d-glucose للحقن، بمقدار 50 microliters وبتركيز 2.5 grams لكل kilo من وزن الجسم. على سبيل المثال، السمكة التي تزن 0.6 gram ستتلقى 50 microliters من محلول PBS يحتوي على 3%d-glucose. ضع السمكة على ظهرها، وثبتها بيد واحدة.

باستخدام اليد الأخرى، أدخل إبرة السرنجة في التجويف البريتوني، ثم احقن محلول d-glucose PBS ببطء. اسحب الإبرة، وأعد السمكة إلى حوض الماء. راقب السمكة حتى تتعافى تماماً.

عادةً ما يتم قياس مستويات جلوكوز الدم لديهم بعد مرور 1 1/2 ساعة. ومن أجل محاكاة فرط سكر الدم المزمن، قم بتحضير خزان سعة لترين من d-glucose، بتركيز نهائي قدره 111 millimolar. ولهذا الغرض، قم بوزن 40 جرامًا من d-glucose، ووضعها في خزان فارغ.

املأ الخزان بلترين من ماء الأسماك، وضع فيه ما يصل إلى سبعة أسماك. استبدل محلول الجلوكوز كل يومين، وذلك لتجنب نمو البكتيريا أو الكائنات الدقيقة الأخرى. ويتم تحقيق فرط سكر الدم المزمن من خلال العلاج بـ d-glucose لمدة 14 يومًا.

اصطد سمكة باستخدام شبكة صيد، وضعها على الثلج. غطِّ السمكة بالثلج لإتمام عملية القتل الرحيم السريع. خذ السمكة وامسحها لإزالة أي قطرات ماء قد تؤدي إلى تخفيف عينات الدم.

قم بإزالة إحدى العينين باستخدام ملقط التشريح، وانتظر حتى تمتلئ تجويف العين بالدم. ضع شريط اختبار في جهاز قياس الغلوكوز، ثم أدخل الشريط في تجويف العين. سجل قيمة تركيز غلوكوز الدم.

بالنسبة لفرط سكر الدم الحاد، يؤدي الحقن داخل الصفاق بـ d-glucose إلى زيادة ملحوظة في مستويات جلوكوز الدم، كما هو موضح، بعد ساعة ونصف من الحقن. أما بالنسبة لفرط سكر الدم المزمن، فإن غمر الأسماك في محلول d-glucose يؤدي إلى زيادة ملحوظة في مستويات جلوكوز الدم، كما هو موضح بعد 14 يوماً من العلاج. وفي نهاية الإجراء، افصل الجسم عن الرأس باستخدام مقص التشريح، وضع الرأس في 4% من paraformaldehyde، المخففة في PBS لإجراء تجارب الكيمياء النسيجية المناعية.

تُحضن العينات طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وبدلاً من ذلك، يمكن استخراج الدماغ مباشرة وتجميده لتجارب أخرى، مثل استخراج mRNA. وفي اليوم التالي، تُشطف الرؤوس المثبتة باستخدام PBS، ويتم تثبيتها بواسطة إبرة تحت مجهر تشريحي.

تتم إزالة العين المتبقية، ويُفتح الجزء العلوي من الجمجمة برفق باستخدام الملقط. بعد ذلك، يُستخرج الدماغ بعناية ويوضع في 1x PBS. تُجفف الأدمغة المثبتة تدريجياً، وذلك عبر سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة، يليها حمامان من التولوين لمدة 30 دقيقة لكل منهما.

توضع الأدمغة بعد ذلك في كاسيت التضمين، ويُغلق الغطاء بعناية. يُوضع الكاسيت في شمع البارافين المذاب، عند 58 إلى 60 درجة celsius. وأثناء عملية تضمين الدماغ في البارافين، يتم تشغيل ملقط التضمين المسخن.

ضع الكاسيت في حمام بارافين نظيف. وفي نهاية حمامات البارافين، أخرج الكاسيت. صب بعض البارافين السائل في قالب.

افتح الكاسيت، وضع الدماغ داخل البارافين المنصهر في القالب. قم بتوجيه الدماغ باستخدام ملقط التضمين المسخن. املأ القالب بالبارافين المنصهر، واتركه يتصلب على الجزء المبرد من جهاز التضمين.

لأسباب تقنية، يجب وضع الدماغ وفقاً للمحور الأمامي الخلفي. بعد إزالة قالب البارافين، قم بقصه وتثبيته في كاسيت باستخدام البارافين المذاب، بالاتجاه الصحيح للسماح بإجراء قطاعات مستعرضة. ضع قالب البارافين في ذراع الميكروتوم، وقم بقص قطاعات بسمك 50 ميكرومتر، حتى الوصول إلى مستوى عينة الدماغ.

بعد ذلك، قم بتقليم قالب البارافين للحصول على شكل شبه منحرف، واضبط سمك القطع على 7 µm. اجمع شرائط البارافين باستخدام فرشاة رسم دقيقة، وضعها على ورقة سوداء. قم بقص شرائط البارافين كل ثلاث إلى أربع قطاعات.

ضع شريحة على لوح تسخين، وغطِّها بالماء المقطر. ضع المقاطع برفق فوق الماء الموجود على الشريحة، وسخنها حتى 40 °C. عندما تتمدد شرائط البارافين بشكل كافٍ، أزل الماء باستخدام منديل ورقي ممتص.

تتم إزالة القطرات الأخيرة ميكانيكيًا، كما هو موضح. تُترك الشريحة لتجف لمدة ساعتين على الأقل قبل إجراء عملية الكيمياء النسيجية المناعية الموضحة في البروتوكول. بعد الكيمياء النسيجية المناعية، تُحلل الشرائح تحت مجهر الفلورة فوق البؤرية، أو مجهر بؤري، لدراسة تأثير فرط سكر الدم على تكاثر خلايا الدماغ.

يتم إجراء التقدير الكمي لخلايا الدماغ على ثلاث قطع متتالية على الأقل، أو في منطقة اهتمام محددة. هنا، تظهر الخلايا التكاثرية المقابلة للخلايا الإيجابية لـ PCNA باللون الأخضر. وكما يتضح، يؤدي فرط سكر الدم المزمن إلى انخفاض في عدد الخلايا التكاثرية، الملونة بالأخضر باستخدام جسم مضاد لـ PCNA، في التلفنصف الكروي البطني، والتلفنصف الكروي الظهري، والوطاء الذيلي، حول الرتج الجانبي والخلفي.

بدلاً من ذلك، ولدراسة تأثيرات فرط سكر الدم على تكوين الخلايا العصبية الناجم عن الإصابة، يمكن إجراء إصابة بجرح طعني في الدماغ الطرفي أثناء العلاج المزمن بفرط سكر الدم. لهذا الغرض، قم بتخدير سمكة عولجت لمدة سبعة أيام، وضعها تحت مجهر تشريحي. ادفع حقنة عيار 30 رأسيًا عبر الجمجمة، وصولاً إلى مركز نصف الكرة الدماغية الطرفية اليمنى.

بعد هذا الإجراء، يجب إعادة السمكة إلى حوضها للمدة المطلوبة. هنا، تُرِكت السمكة لتعيش لمدة سبعة أيام في ماء يحتوي على d-glucose، قبل أن يتم تضحيتها. تؤدي إصابة التلفنصيف (telencephalon) بجرح طعني إلى زيادة قوية في معدل التكاثر في نصف الكرة المصاب، بعد سبعة أيام من الإصابة.

تُظهر بياناتنا أن فرط سكر الدم المزمن يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في عمليات التئام الدماغ، وذلك عن طريق تقليل تكاثر الخلايا بعد إصابة الدماغ الطرفي بجرح طعني. كما يمكن استخدام أسماك الزيبرا لدراسة التوزيع الحيوي للجزيئات الملحقة بنظائر مشعة. وبناءً على ذلك، قررنا دراسة استقلاب الجلوكوز في كائن الزيبرا.

يجب تخدير الأسماك أولاً، ووضعها على نسيج مشبع بالمواد المخدرة. ثم توضع الأسماك خلف نافذة حماية من الإشعاع. يتم تحضير المحقنة التي تحتوي على 50 µL من الفلوروديوكسي جلوكوز.

يتم وضع السمكة على ظهرها، وتُحقن داخل التجويف البريتوني بـ 50 µL من FDG بتركيز 20 MBq. ثم تُوضع السمكة على نسيج آخر مشبع بالمخدرات، وتُلف بعناية، ثم تُوضع على ذراع جهاز التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET scan).

يتم إدخال الذراع في جهاز التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET scan)، ومن ثم تُجرى عملية التصوير. هنا، يمكنك ملاحظة أن FDG لا يُكتشف فقط في موقع الحقن، بل وأيضاً في رأس السمكة، ولا سيما في الدماغ، وعلى طول الحبل الشوكي. في هذه الدراسة، نقدم طريقتين مختلفتين لإحداث حالة فرط سكر الدم الحاد والمزمن في أسماك الزيبرا، ونبين أن فرط سكر الدم يضعف تكاثر خلايا الدماغ في الظروف الطبيعية وظروف الإصابة.

في الختام، يمكن استخدام أسماك الزيبرا كنماذج ذات صلة لبحث الآثار الضارة لفرط سكر الدم في الجهاز العصبي المركزي. كما تتيح هذه النماذج تقييم التوزيع الحيوي للجزيئات المحددة إشعاعياً عن طريق التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET scan).