Name: مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: اكتشف طريقة أخذ العينات بالإسفنج الكبير للكشف عن نوروفيروس على الأسطح الصلبة. تُحسّن هذه البروتوكول فهم ديناميكيات التلوث البيئي وتقييم استراتيجيات التعقيم.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفون ليس لديهم أي اعترافات.

1. مسحة أخذ العينات في الميدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتداء زوج من القفازات النظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس حجم المنطقة أخذ العينات دون لمس السطح باستخدام شريط قياس أو الحاكم. محاولة لتقدير المساحة بأكبر قدر ممكن، وملء استمارة التقرير (الجدول التكميلي 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق عدة مسحة لالتسربات المحتملة وأكياس نقل العينات التسمية ومجموعات مسحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مسحة في جميع أنحاء المنطقة أخذ العينات على النحو التالي: ضربة واحدة في الاتجاه الأفقي، بضربة واحدة في الاتجاه الرأسي، وبضربة واحدة في اتجاه قطري. لا مسحة مساحة أكبر من 700 سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل مسحة في أنبوب وإحكام الغطاء بإحكام. </li></ol> 2. التخزين والنقل من مسحات إلى المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على مسحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. إذا كان المطلوب التخزين لفترات أطول، وتخزين مسحات في -20 درجة مئوية (أو -70 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الأنابيب في 0-4 درجة مئوية (أي. استخدام حزم الباردة) في وعاء معزول أثناء النقل إلى المختبر وتشحن في غضون 24-48 ساعة من جمعها. </li></ol> 3. تركيز الفيروسات، الفيروسي RNA استخراج وتنقية ملاحظة: جميع الخطوات الطرد المركزي تستخدم أجهزة الطرد المركزي الجدول أعلى في 5000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك. كن حذرا عند التعامل مع العازلة العالمي استخلاص الحمض النووي (UNEX). ارتداء نظارات واقية أو درع الوجه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية واحدة 15 مل أنبوب واحد العمود RNA ميدي لكل عينة. تشمل مراقبة استخراج السلبية في كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل تحلل لمدة 10 مسحات، خلط 25 مل من العازلة UNEX مع 25 مل من PBST (PBS الرقم الهيدروجيني 7.2 تحتوي على 0.02٪ توين-80). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من تعليق عاثية العصية القولونية MS2 (10 6 PFU / ميكرولتر) إلى 50 مل من محلول تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مسحة في أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من محلول تحلل. خلط واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة 5 مل الإيثانول بنسبة 100٪ لكل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية مسحة من أنبوب 15 مل (أنه يحتوي على عازلة UNEX) الضغط برفق على جانب من أنبوب لإزالة السائل الزائد ثم تجاهل مسحة. وينبغي أن تكون الكميات المتبقية بين 9-10 مل. </li></ol> 4. ميدي العمود الفيروسية نوكليك حمض استخراج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية 4.5 مل UNEX / الايثانول خليط من الخطوة 3.6 على عمود ميدي، الطرد المركزي والتخلص من الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 4.5 مل أخرى من نفس الخليط على العمود نفسه، الطرد المركزي، وتجاهل الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الأولى، إضافة 3.5 مل من الايثانول 70٪ على ميدي العمود، الطرد المركزي والتخلص من الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الثاني، إضافة 3.5 مل أخرى من 70٪ من الإيثانول على العمود ميدي. الطرد المركزي والتخلص من الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالجاف تدور، الطرد المركزي الأعمدة ميدي لإزالة كل آثار الإيثانول (والتي يمكن أن تؤثر سلبا على الانتعاش RNA الفيروسي الخاص بك). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ضع عمود ميدي في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. إضافة 250 شطف العازلة ميكرولتر على العمود ميدي. الانتظار لمدة 1 دقيقة قبل الطرد المركزي للحصول على أعلى الانتعاش RNA الفيروسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحمض النووي المستخرج في -70 درجة مئوية أو الشروع فورا في الخطوة 5. </li></ol> 5. تركيز الأحماض النووية الفيروسية عن طريق الحمض النووي الريبي النظيفة والمكثف أطقم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة ملزمة إلى 250 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مزال في الخطوة 4.7 أعلاه ودوامة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 750 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪ ودوامة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية عمود الدوران لكل عينة. تحميل العينة 750 ميكرولتر على عمود الدوران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الأعمدة تدور في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 750 ميكرولتر المتبقية على عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمرحلة ما قبل الغسيل، وإضافة 400 ميكرولتر العازلة RNA الإعدادية لكل عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الأولى، إضافة 800 ميكرولتر RNA الاحتياطي اغسل إلى كل عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الثاني، إضافة 400 ميكرولتر RNA الاحتياطي اغسل تدور العمود والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالجاف تدور، الطرد المركزي عمود الدوران لإزالة كل آثار غسل العازلة في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية عمود الدوران إلى أنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر شطف العازلة على عمود الدوران واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سيؤدي هذا إلى زيادة الانتعاش من الحمض النووي الريبي الفيروسي من العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي عمود الدوران في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إما الانتقال مباشرة إلى RT-QPCR (الخطوة 6) أو تخزين الحمض النووي الريبي في -70 درجة مئوية. </li></ol> 6. Mutiplex RT-QPCR الكشف عن Genogroup الأول، والثاني Noroviruses، وعاثية العصية القولونية MS 2 (الجدول التكميلي 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسطح عمل نظيفة، pipettوفاق، وأجهزة الطرد المركزي مع ريبونوكلياز الحل لإزالة التلوث للحد من تلوث محتمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الكواشف RT-QPCR على الجليد. RNA ذوبان على الجليد (في منطقة / غرفة منفصلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد من ردود الفعل وإضافة 10٪ على الأقل أكثر منها (على سبيل المثال إذا كانت هناك حاجة 10 ردود الفعل، وجعل مزيج الرئيسي ل11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكونات مزيج الرئيسي الفردية دوامة، باستثناء 25X RT-QPCR الانزيم، لمدة 5 ق. بعناية مزيج انزيم عبها الأنبوب مع إصبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة مكونات مزيج الرئيسي الطرد المركزي لمدة 5 ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الرئيسي لالحقيقي كشف RT-PCR من GI نوروفيروس وGII وفقا للتعليمات عدة وإضافة الاشعال النوكليوتيد-نوروفيروس محددة وتحقيقات في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge (الجدول التكميلي 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط مزيج الرئيسي من قبل pipetting 5-10 مرات صعودا وهبوطا (لا ينصح vortexing ل). قسامة 22 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر في الوقت الحقيقي PCR لوحة 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة عينة الحمض النووي الريبيلمدة 5 ثوان، وجمع من قبل وجيزة (5 ق) الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي والجهاز الهضمي وGII الضوابط الإيجابية لوحة RT-QPCR (اتبع قالب من الجدول 2). إضافة 3 ميكرولتر من نوكلياز-freewater في الآبار عدم قالب التحكم (NTC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة في الوقت الحقيقي مع الفيلم لاصقة البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية أجهزة الطرد المركزي لوحة في الوقت الحقيقي في 1300 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء أو قطرات سائلة التي قد تكون موجودة في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء الوقت الحقيقي PCR الصك وانشاء الظروف الحراري thermocycling التالية: 1) خطوة RT لمدة 10 دقيقة. في 45 ° C (2) تفعيل طق البلمرة، 10 دقيقة. في 95 درجة مئوية و (3) 45 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و60 ثانية في 60 درجة مئوية. </li></ol> 7. الكمي من نوروفيروس في عينات المسحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق نتائج الضوابط الإيجابية والسلبية للتحقق من صحة النتائج RT-QPCR (الجدول التكميلي 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد ما إذا كان كل منحنى قياسي يفيالقيم المقبولة الواردة في الجدول التكميلي 2 وحساب الانحراف المعياري العام للمنحنى قياسي باستخدام المعادلة 1. (المعادلة 1)٪ كفاءة = 100 × 10 (متوسط ط م القيم-الإعتراض) / المنحدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم PCR برنامج cycler الحرارية حساب المنحدر لكل المنحنى القياسي، تحديد المنحدر و R 2 القيم عن طريق الانحدار باستخدام برنامج إحصائيات (مثل إكسل، SPSS، أو SAS). وبالإضافة إلى ذلك، وحساب الكفاءة٪ لمنحنيات القياسية التالية المعادلة أنا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل عدد نسخ الحمض النووي الريبي وتحسب على أساس برنامج cycler الحرارية لجميع عينات الاختبار استنادا إلى المنحنيات القياسية التي تفي بالمعايير المحددة في الجدول التكميلي 4. إعادة تشغيل أي عينات مع المنحنيات القياسية قبعة ر لا تلبي معايير أو ضوابط إيجابية كاذبة. تحقق القيم ط م من عاثية العصية القولونية MS2، الذي اضاف باعتبارها الرقابة الداخلية لمراقبة PCR تثبيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد العدد الإجمالي من الحمض النووي الريبي نسخ صعينة إيه من ضرب عدد نسخ الحمض النووي الريبي المحسوبة في الخطوة 7.2 من نسبة حجم (25-50 ميكرولتر) من إجمالي شاطف RNA إلى أن من الحمض النووي الريبي (3-5 ميكرولتر) المستخدمة للتفاعل RT-QPCR. بدلا من ذلك، حساب كثافة الحمض النووي الريبي عن طريق قسمة إجمالي عدد نسخ الحمض النووي الريبي في منطقة سطح الجسم (سم 2) تحليلها. </li></ol> 8. التنميط الجيني لفي الوقت الحقيقي العينات RT-PCR إيجابي من قبل هيمي متداخلة التقليدية PCR التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الجولة الأولى من مزيج الرئيسي لكل مجموعة التمهيدي للفحص RT-PCR (الجداول التكميلية 2 و 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من نوروفيروس RNA إيجابية ل20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل RT-PCR وفقا للشروط التالية: (1) RT خطوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية (2) تفعيل طق البلمرة، و 15 دقيقة في 95 درجة مئوية، و (3) 40 دورات من 30 ثانية في 95 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 50 درجة مئوية، و 60 ثانية في 72 درجة مئوية. بعد 40 دورة، واحتضان لمدة 10 دقيقة إضافية عند 72 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تحضير الجولة الثانية من مزيج الأم لكل مجموعة التمهيدي للفحص RT-PCR (الجداول التكميلية 2 و 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مزيج الرئيسي 23 ميكرولتر وإضافة 2 ميكرولتر من الدور الاول المنتجات RT-PCR (من الجولة الأولى) إلى كل أنبوب (مثالي المنتج الجولة الأولى يجب تخفيفه 10/01 في ريبونوكلياز خالية من المياه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 8.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد agarose هلام 2٪ في EDTA 100 مل 1X تريس، خلات (40 ملي تريس، 20 ملم حمض الخليك، و1 ملم EDTA، في درجة الحموضة 8.3). بعد حل الاغاروز عن طريق تسخين الخليط في فرن الميكروويف، وإضافة 10 ميكرولتر من وصمة عار الحمض النووي لكل 100 مل من هلام مستعدة بعد تبريد الخليط إلى 60-70 درجة مئوية، صب جل وإدراج أمشاط. السماح للهلام يستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 15 ميكرولتر من كل منتج RT-PCR مع 3 ميكرولتر من صبغ تحميل 6X. تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة وelectrophorese هلام الاغاروز في 100 فولت لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شظايا المكوس الهدف RT-PCR ذات حجم مناسب (330 نقطة أساس لمعهد جوته و 341 نقطة أساس لGII) من هلامد تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الهلام التجارية. ويمكن الآن للمنتج PCR المنقى أن تستخدم لسانجر التسلسل. </li></ol>

<ol><li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+transmission+on+cruise+ship%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li>
<li>Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22440972">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat%2C+Grand+Canyon%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3880795/">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li>
<li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate%2C+Bacteriophage+MS2%2C+during+Simulated+Vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277(2015).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+50%25+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li>
<li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5651a2.htm">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li>
<li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li>
<li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li>
<li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li>
<li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12560-008-9007-0">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li>
<li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li>
<li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaliciNet%3A+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li>
<li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internally+controlled%2C+one-step%2C+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li>
<li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li>
<li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus%3A+how+infectious+is+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li>
<li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate%2FEDTA-pretreated+chromatography+paper+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li>
<li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27154208">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=55382">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).</li>
<li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+to+defining+%22high-touch%22+surfaces+in+hospitals%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility%3A+the+role+of+environmental+surface+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li>
<li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li>
<li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li>
<li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li>
<li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li>
</ol>

المؤلفون ليس لديهم مصالح متضاربة. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي نتائج المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي لمراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها.

Noroviruses لها الجرعة المعدية الإنسان 50٪ بين 18 و 10 3 جزيئات الفيروس 20. ولذلك، حتى التلوث على مستوى منخفض من الأسطح قد تشكل خطرا على الصحة العامة. تم تقييم عدة جوانب بروتوكول أخذ العينات مسحة بما في ذلك: 1) المواد مسحة مختلفة، 2) مسحات حالة التخزين أثناء النقل، 3) تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي، و 4) عاثية العصية القولونية MS2 عن السيطرة استخراج الداخلية. حتى وقت قريب، إ...

<html> noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لانتشار الوباء والتهاب المعدة والأمعاء الحاد متفرقة في جميع أنحاء العالم 1، 2، 3. فيروس معد للغاية ويحدث انتقال العدوى عن طريق الشخص المباشر للشخص التفاعل أو بشكل غير مباشر من خلال اتصال مع الغذاء الملوث أو الماء أو الأسطح البيئية. Noroviruses يمكن تسليط لفترات طويلة وطويلة بقاء الفيروس على الأسطح البيئية وقد تم توثيق 1، 2، 3. خلال ذروة سفك، يتم الإفراج عن المليارات من جزيئات الفيروس في كل غرام من البراز، ويحتوي على القيء أيضا وجود عدد كاف من الجسيمات الفيروسية أن تسبب عدوى 4، 5، 6، 7، 8،EF &quot;&gt; 9 و 10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث نقل الفيروس بين الأسطح غير حية وجلد الإنسان بسهولة 2، 11، 12. وبالتالي، رصد التلوث البيئي قد تساعد في التحقيقات اندلاع وفي تقييم فعالية تنظيف و إجراءات التطهير. وقد وصفت عدة بروتوكولات أخذ العينات البيئية للكشف عن فيروس الروتا، عاثية العصية القولونية MS2، الفيروسة الكأسية القطط (FCV)، والجراثيم P22 13، 14، 15، 16. ومع ذلك، فإن الظروف التحقق من صحة وصفها في هذه الدراسات، بما في ذلك جفاف سريع (&lt;1 ساعة) ومساحات صغيرة (25 × 100 سم 2)، قد لا تمثل إعدادات المجال على نحو كاف. بالإضافة إلى ذلك، من المتوقع مستويات تلوث منخفضة من بيئىتتطلب الأسطح nmental البروتوكولات التي هي قادرة على الكشف عن عدد قليل جدا من جزيئات الفيروس. قمنا بتطوير طريقة أخذ العينات السطحية القائمة على macrofoam للكشف والكتابة من نوروفيروس. تم التحقق من صحة هذه الطريقة خلال عدة تفشي نوروفيروس. ويتضمن البروتوكول 1) كيفية جمع عينات مسحة من الأسطح البيئية (2) كيفية الحفاظ على أفضل سلامة العينات أثناء جمع والشحن إلى المختبر، و3) الاختبارات المعملية والكتابة من نوروفيروس.

<table><tbody><tr><td><قوي>اسم عام للمجموعات</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam swab</td> <td>premoistened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>البيوريتان</td><td>2588060PFUW</td></tr><<tr><td>strong>RNA Lysis Buffer&nbsp; < / قوي></td><td>CDC UNEX العازلة</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>RNA استخراج العمود التدوير< / قوي></td><td>Midi العمود</td><td>أوميغا Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>RNA تنقية العمود التدوير< / قوي></td><td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit &nbsp;</td><td>مجموعة Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td> Real Time RT-PCR kit</td><td>AgPath Kit RT-PCR بخطوة واحدة</td> تقنيات <td>الحياة Cat</td><td>No</td></tr> <tr><td>4387391 طقم RT-PCR التقليدي< / قوي></td><td>Qiagen طقم RT-PCR بخطوة واحدة</td><td>طقم Qiagen</td> Cat <td>No 210212</td></tr><tr><td>Gel Extract</td><td>Qiagen QIAquick gel extract</td><td>kit Qiagen kit</td><td>Cat رقم 28704 أو 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat رقم 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>نصوص جريان الحمض النووي الريبي منصة</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Realtime PCR</td><td>الأنظمة الحيوية التطبيقية</td><td>نموذج ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>لوحة تفاعل بصرية 96 بئر</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat رقم 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& معرف المنتج = 4306311 & _bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9٪2BUkO6scMYGEmWnqX3٪0A5Mec8e0p٪2BGbUKWZMlFkNYTIa4h٪2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT٪0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd. 0exacF6LkD5h٪2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy٪0AjD6Yf٪2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY٪0AvUrQ٪2BTAjAt88w4zlm8Ly٪2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt٪2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx٪ 0AD9Q0vydo9rrs4te675٪2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA٪3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com٪ 3A80٪ 2Forder ٪ 2 F كتالوج ٪ 2 Fen ٪ 2FUS ٪ 2Fadirect ٪ 2Flt ٪ 3Fcmd ٪ 3DcatDisplayStyle٪ 26catKey ٪ 3D101٪ 26 فلتر نوع ٪ 3D1 ٪ 26OP٪ 3Dfilter ٪ 26 فلتر ٪ 3Dft_1101٪ 252Ff_2005260 * "> ميكروأمبير فيلم لاصق شفاف &nbsp ؛ < / a></td> <td>الحرارية العلمية</td><td>القط رقم 4306311</td></tr></tbody></table>

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لانتشار الوباء والتهاب المعدة والأمعاء متفرقة في جميع أنحاء العالم. لأنه إما تنتشر معظم حالات العدوى مباشرة عبر الطريق من شخص إلى شخص أو بشكل غير مباشر من خلال الأسطح البيئية أو المواد الغذائية، الملابس والأشياء الملوثة والأسطح غير حية هي وسائل هامة لانتشار الفيروس خلال تفشي نوروفيروس. قمنا بتطوير وتقييم بروتوكول باستخدام مسحات macrofoam للكشف والكتابة من noroviruses الإنسان من الأسطح الصلبة. مقارنة مع مسحات ذات الرؤوس الألياف أو مناديل التحجر، ومسحات macrofoam تسمح الانتعاش فيروس (المدى 1،2 حتي 33،6٪) من الأسطح مقعد المرحاض لمدة تصل إلى 700 سم 2. ويتضمن البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخراج الفيروس من مسحات ومزيد من تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام الأعمدة تدور. في المجموع، 127 (58.5٪) من 217 عينات المسحة التي تم جمعها من الأسطح في السفن السياحية ومرافق الرعاية طويلة الأجل حيث نوروفيروس التهاب المعدة والأمعاء كانذكرت ثبتت اصابتهم GII نوروفيروس بواسطة RT-QPCR. هذه 29 (22.8٪) يمكن مرمزة بنجاح. وفي الختام، والكشف عن نوروفيروس على الأسطح البيئية باستخدام بروتوكول ضعنا يمكن أن تساعد في تحديد مستوى التلوث البيئي خلال تفشي وكذلك الكشف عن الفيروس عندما العينات السريرية غير متاحة؛ كما أنها قد تسهل رصد فعالية استراتيجيات العلاج.

ويعرض الشكل 1 مخطط للبروتوكول أخذ العينات مسحة. يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات رئيسية. 1) جمع العينات، 2) تخزين العينات والنقل، 3) الفيروسية تنقية الحمض النووي الريبي وتركيز و4) RT-QPCR فحص والتنميط الجيني. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> الشكل 1: مخطط تدفق البروتوكول النهائي لأخذ ال...

تم تطوير وتقييم منهجية أخذ العينات القائمة على الرغوة الكبيرة للكشف عن نوروفيروس وقياسه على الأسطح الصلبة البيئية.

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

الهدف العام من طريقة أخذ عينات الأسطح القائمة على الرغوة الكبيرة (macrofoam) هو تحديد مسبب تفشي المرض، والتقييم الشامل لديناميكيات التلوث البيئي للفيروس، وفعالية استراتيجيات المعالجة لفيروس النوروفيروس (norovirus). ويوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية جمع عينات المسحات من الأسطح البيئية وكيفية تخزين هذه المسحات ونقلها، والبروتوكولات المختبرية الموصى بها للكشف عن النوروفيروس وتحديده نمطياً من هذه المسحات. وتتمثل التحسينات الواضحة في بروتوكول المسحات البيئية الخاص بالنوروفيروس في أننا حددنا أفضل نوع من مواد المسحات، وكمية النوروفيروس التي يمكن استخلاصها من الأسطح الصلبة، وإمكانية استخدام البروتوكول بفعالية لأخذ عينات من مساحات سطحية أكبر.في هذا الفيديو، سيقوم اثنان من العلماء العاملين معي، وهما Geun Woo Park و Preeti Chhabra، بشرح بروتوكول المسح بالكشط للكشف عن الفيروسات المعوية (noroviruses) وتحديد أنواعها. لبدء عملية المسح، توجه إلى منطقة أخذ العينات ومرر المسحة عبر منطقة العينة بحركة واحدة في الاتجاه الأفقي، وحركة واحدة في الاتجاه العمودي، وحركة واحدة في الاتجاه القطري. ضع كل مسحة في أنبوب منفصل وأحكم إغلاق الغطاء جيداً.قم بأخذ مسحات من أسطح من الفولاذ المقاوم للصدأ، ومسحة من سطح مقعد مرحاض، ومسحة من مقبض باب. بعد ذلك، قم بتسمية أنبوب واحد سعة 15-milliliter وعمود RNA Midi واحد لكل عينة. قم بتضمين ضابط استخلاص سلبي في كل تجربة.قم بتجهيز زجاجة فارغة لجمع نفايات محلول استخلاص الأحماض النووية العام أو UNEX. ولتحضير محلول التحلل لـ 10 مسحات، اخلط 25 milliliters من محلول UNEX المنظم مع 25 milliliters من PBST. أضف 50 microliters من معلق coliphage MS2 إلى 50 milliliters من محلول التحلل.ضع مسحة في أنبوب سعة 15 milliliter، وأضف خمسة milliliters من محلول التحلل. اخلط المسحة في المحلول، واترك المزيج في درجة حرارة الغرفة. أضف خمسة milliliters من 100% ethanol إلى كل أنبوب، ثم قم برج الأنابيب باستخدام جهاز vortex لمدة 10 seconds.أخرج المسحة بعناية من الأنبوب سعة 15 ملليلتر، مع ضغطها برفق على جدار الأنبوب للتخلص من السائل الزائد، ثم تخلص من المسحة. انقل بعناية 4.5 ملليلتر من خليط إيثانول UNEX إلى عمود Midi، ثم قم بطرد العمود مركزياً. بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الرشاحة.قم بتحميل 4.5 milliliters أخرى من المزيج نفسه على العمود نفسه، ثم قم بطرد العمود مركزياً. تخلص من الراشح. بالنسبة للغسلة الأولى، أضف 3.5 milliliters من 70%ethanol على عمود Midi، وقم بطرد العمود مركزياً.بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الراشح. وفي عملية الغسل الثانية، أضف 3.5 milliliters أخرى من 70%ethanol إلى عمود Midi. ثم قم بإجراء الطرد المركزي وتخلص من الراشح.لإجراء عملية الدوران الجاف، قم بتركيز أعمدة Midi باستخدام جهاز الطرد المركزي لإزالة جميع آثار الإيثانول. ضع عمود Midi في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مليلتر. أضف 250 µL من محلول استخلاص (elution buffer) فوق عمود Midi، وانتظر لمدة دقيقة واحدة قبل القيام بعملية الطرد المركزي لضمان الحصول على أعلى معدل استرداد للرنا (RNA) الفيروسي.أضف 500 µL من محلول ارتباط الـ RNA إلى 250 µL من الـ RNA، ثم قم برج المزيج باستخدام جهاز المرج (vortex) لمدة 10 ثوانٍ. أضف 750 µL من الإيثانول بتركيز 100%، ثم رج المزيج لمدة 10 ثوانٍ. بعد ذلك، ضع ملصق تعريف على عمود طرد مركزي (spin column) لكل عينة.قم بتحميل عينة بحجم 750 µL على عمود دوران، ثم قم بطرد الأعمدة مركزياً. تخلص من السائل المار. قم بتحميل الـ 750 µL المتبقية على عمود دوران، ثم قم بطرد الأعمدة مركزياً.بالنسبة للغسيل المسبق، أضف 400 µL من ناتج RNA prep buffer إلى كل عمود دوران، ثم قم بطرد العمود مركزياً. تخلص من السائل النافذ. وبالنسبة للغسلة الأولى، أضف 800 µL من ناتج RNA wash buffer إلى كل عمود دوران، ثم قم بطرد الأعمدة مركزياً.تخلص من السائل المار. وفي الغسلة الثانية، أضف 400 microliters من محلول غسيل RNA إلى كل عمود دوران، ثم قم بطردهم باستخدام جهاز الطرد المركزي. تخلص من السائل المار.لإجراء عملية التدوير الجاف، قم بطرد مركزي لعمود الدوران لإزالة جميع آثار محلول الغسل. انقل عمود الدوران بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5-milliliter. أضف 25 µL من محلول الاستخلاص على عمود الدوران، واترك العمود لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لزيادة استعادة الـ RNA الفيروسي من العمود.قم بجمع الـ RNA عن طريق طرد العمود الدوراني مركزياً بسرعة 10,000 ×g لمدة دقيقة واحدة. انتقل مباشرة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR). قبل المتابعة في إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي متعدد الأهداف (multiplex real-time RTPCR)، قم بتنظيف أسطح العمل والماصات وأجهزة الطرد المركزي باستخدام محلول لإزالة تلوث الـ RNase.قم بإذابة كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) على الثلج. قم بإذابة RNA الخاص بالعينة على الثلج في منطقة منفصلة. حدد عدد التفاعلات، وجهّز كمية إضافية من الكاشف للمزيج الرئيسي (master mix) بنسبة 10% على الأقل لتعويض الفواقد أثناء عملية السحب والتحويل بالماصة.بعد ذلك، قم برج مكونات المزيج الرئيسي (master mix) كل على حدة باستخدام جهاز الرج vortex لمدة خمس ثوانٍ. امزج الإنزيم بعناية عن طريق نقر الأنبوب. قم بطرد مكونات المزيج الرئيسي مركزياً لفترة وجيزة لمدة خمس ثوانٍ.بعد ذلك، قم بتحضير المزيج الرئيسي (master mix) للكشف عن الفيروس النوروي (norovirus) من النمطين G1 وG2 باستخدام تقنية RTPCR وفقاً لتعليمات الطقم، وأضف البادئات والمجسات قليلة النوكليوتيد الخاصة بالفيروس النوروي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5-milliliter. بعد ذلك، اخلط المزيج الرئيسي عن طريق السحب والضخ بالماصة سبع مرات. وزع 22 microliters من المزيج الرئيسي في كل بئر من ألواح PCR في الوقت الحقيقي.قم برج sample RNA باستخدام جهاز vortex لمدة خمس ثوانٍ، ثم اجمع المحتويات عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس ثوانٍ. أضف ثلاثة µL من الضوابط الموجبة لـ sample RNA وتخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من G1 و G2 RNA transcripts إلى صفيحة real-time PCR. أضف ثلاثة µL من الماء الخالي من النوكلياز (nuclease-free water) في آبار ضابط القالب الفارغ، أو NTC.أغلق الطبق باستخدام فيلم لاصق بصري. قم بطرد الطبق مركزياً بعناية عند 1,300 ×g لمدة دقيقة واحدة لإزالة أي فقاعات هوائية أو قطرات سائلة قد تكون موجودة في الآبار. بعد ذلك، قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR)، وأدخل شروط الدورة الحرارية.قم بتحديد منحنيات المعايرة القياسية لكل من نسخ G1 وG2. حوّل قيم Ct إلى عدد نسخ RNA باستخدام منحنى المعايرة القياسية المقابل. احسب النسبة بين حجم سائل استخلاص RNA الكلي والكمية الإجمالية من RNA المستخدمة في مقايسة الوقت الحقيقي (real-time assay) لحساب العدد الإجمالي لنسخ RNA لكل عينة.لتحديد الأنماط الجينية للعينات الإيجابية لفيروس نوروفيروس باستخدام تقنية RTPCR التقليدية شبه المتداخلة، قم أولاً بتحضير مزيج رئيسي (master mix) للجولة الأولى من RTPCR، ثم وزع حصصاً مقدارها 20 µL في أنابيب PCR مصنفة مسبقاً. أضف 5 µL من الـ RNA إلى كل أنبوب. بعد اكتمال الجولة الأولى من RTPCR، قم بتحضير مزيج رئيسي للجولة الثانية من PCR شبه المتداخلة عن طريق توزيع حصص مقدارها 23 µL في أنابيب جديدة.أخيرًا، أضف 2 µL من ناتج PCR الجولة الأولى إلى كل أنبوبة. تم اختبار طريقة أخذ العينات باستخدام مسحة تعتمد على الماكروفوم ميدانيًا على عينات جُمعت من سفينة سياحية أبلغت عن حالات اشتباه في التهاب المعدة والأمعاء الناتج عن فيروس النوروفيروس. تم تحديد النمط الجيني لأربع من أصل 17 عينة مسحة إيجابية لفيروس النوروفيروس، وكانت جميع العينات تمتلك تسلسلات G2 متطابقة.سمح تحديد الحمل الفيروسي بتقييم الأسطح التي كانت ملوثة بشدة، مثل مقاعد المراحيض. تم تحديد العلاقة بين عتبة الدورة، أو قيم Ct، بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (real-time RTPCR) والقدرة على تسلسل هذه العينات. في المجمل، ظهرت نتيجة إيجابية لـ G2 norovirus في 127 عينة من أصل 217 عينة مسحة تم اختبارها.تم تحديد الأنماط الجينية لعينات المسحات التي تتراوح قيم Ct فيها بين 24 و27 وبين 28 و31 بمعدلات بلغت 100% و72.2% على التوالي. وفي المقابل، تم تسلسل 22% و1.6% فقط من عينات المسحات التي تتراوح قيم Ct فيها بين 32 و36 ومن 37 إلى 40 بنجاح. وكما أوضحنا، يتيح هذا البروتوكول تحديد مستوى التلوث البيئي أثناء تفشي الفيروسات النوروية (norovirus)، والكشف عن السبب المحتمل للتفشي عند عدم توفر عينات سريرية، وأيضاً تحديد مدى فعالية ممارسات التنظيف.للحصول على النتيجة الأكثر دقة، من المهم جداً اتباع هذا البروتوكول بدقة لتقليل التباين في النتائج بين العينات المختلفة.

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

وخطوة واحدة RT-PCR فحص للكشف وتحديد genogroup من العزلات نوروفيروس من براز الأطفال، والتي تستخدم الاشعال وتحقيقات TaqMan محددة لإطار القراءة المفتوح 1 (ORF1)-ORF2 منطقة تقاطع، وهي المنطقة الأكثر حفظها من الجينوم نوروفيروس هو وصفها. وترد تفاصيل وغير التجاري، واستخراج الحمض النووي الريبي طريقة فعالة من حيث التكلفة.

كشف وGenogrouping من Noroviruses من براز الأطفال وذلك في خطوة واحدة Taqman RT-PCR

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس الجسيمات الشبيهة بفيروس نوروفيروس البشري (VLPs) المرتبطة بالبكتيريا المعوية البشرية. يتم خلط المعلقات البكتيرية مع VLPs وتحضنها للسماح بتكوين مجمعات بكتيريا VLP. ثم يتم تصنيف المجمعات بأجسام مضادة خاصة ب VLP الموسومة بالفلوروفور ، متبوعة بالتصور والقياس الكمي القائم على قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للبكتيريا المرتبطة ب VLP.

اختبار لتحديد ارتباط نوروفيروس VLPs البشري بالبكتيريا المعوية

تستخدم طريقة EPA Method 1615 مرشحا إيجابيا للكهرباء لتركيز الفيروسات المعوية ونوروفيروسات في المياه البيئية ومياه الشرب. تصف هذه المخطوطة إجراءات جمع العينات لتحليلات الطريقة 1615.

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس حدوثها في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. I. جمع عينات الفيروسات

نقدم هنا إجراء لقياس إجمالي الفيروسات القابلة للزراعة باستخدام خط خلايا الكلى Buffalo Green Monkey. يوفر الإجراء أداة موحدة لقياس حدوث الفيروسات المعدية في المياه البيئية ومياه الشرب.

وكالة حماية البيئة الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية وقوع نوروفيروس في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. II. مجموع زروع الفحص الفيروسات

نقدم هنا إجراء لتحديد الفيروس المعوي والنوروفيروس في المياه البيئية ومياه الشرب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي. كان متوسط تعافي الفيروس من المياه الجوفية باستخدام هذا الإجراء الموحد من طريقة وكالة حماية البيئة 1615 20٪ لفيروس شلل الأطفال و 30٪ لفيروس نوروفيروس الفئران.

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس التواجد في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. الجزء الثالث. كشف الفيروس عن طريق RT-QPCR

أساليب الكشف الروتيني استخدام الجينوم الفيروسي التضخيم مقيدة بعجزهم عن تميز المعدية من جسيمات غير معدية. والغرض من هذه المقالة توفير بروتوكولات مفصلة عن طرق بديلة للمساعدة على تمييز جزيئات نوروفيروس المعدية استخدام ابتمر ملزمة، وتشتت الضوء الديناميكي، ومجهر إلكتروني.

أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.

تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا

تم تصميم مشروع علمي للمواطنين لتوظيف سكان سان دييغو لجمع عينات بيئية للسارس-CoV-2. تم إنشاء نظام أساسي متعدد اللغات على شبكة الإنترنت لتقديم البيانات باستخدام واجهة جهاز محمول سهلة الاستخدام. ويسر نظام لإدارة المعلومات المختبرية جمع آلاف العينات المتنوعة جغرافيا مع تتبع النتائج في الوقت الحقيقي.

مسح البيئة الحضرية - خط أنابيب لأخذ عينات من السارس -CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية

هذا البروتوكول وصف بسيط لاصق الشريط النهج القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها السريع كشف الخلية...

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

ممارسة قادر على إحداث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المناعية. هناك حدود القياس المختلفة ، لا سيما فيما يتصل مقدار الوقت اللازم لعزل ومعالجة عينة من الدم قبل التقييم. تظاهر هو إجراء سريع ومينيملي لتحليل ممارسة النشاط الخلايا اللمفاوية.

الاصبع العصا منهجية أخذ عينات من الدم لتحديد بممارسة المستحثة الأبوطوزيس اللمفاويات

اكتشف طريقة أخذ العينات بالإسفنج الكبير للكشف عن نوروفيروس على الأسطح الصلبة. تُحسّن هذه البروتوكول فهم ديناميكيات التلوث البيئي وتقييم استراتيجيات التعقيم.

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

استكشف المزيد من الفيديوهات