تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

الهدف العام من هذه الطريقة هو تركيب أجنة الزرد للتصوير الحي ، مما يتيح النمو الطبيعي لمنطقة الجسم الخلفية. يمكن تكييف هذه الطريقة لتصوير مناطق أخرى من أسماك الزرد النامية. تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي ، مثل كيف تؤدي سلوكيات الخلايا الفردية إلى تكوين التشكل على مستوى الأنسجة الكاملة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح اللحظة الحرة للجسم الخلفي مع الحفاظ على الجنين في الاتجاه الصحيح. للبدء ، أضف agarose نقطة انصهار منخفضة بتركيز نهائي قدره 1.5٪ إلى E3 وسط في أنبوب سعة 50 مليلتر ، وقم بإذابة agarose عن طريق التسخين في الميكروويف. اسمح للمحلول بالتوازن عند 42 إلى 45 درجة مئوية في حمام مائي أو حاضنة علوية على مقاعد البدلاء.

بعد سحب الإبر الزجاجية وفقا لبروتوكول النص. باستخدام زوج من الملقط ، اكسر الإبرة بعد النقطة التي تنثني فيها لإنشاء إبرة نظيفة وحادة لتوجيه الأجنة وإزالة الاغاروز الزائد. ارفع الأجنة إلى المرحلة المناسبة في وسط E3.

ثم تحت مجهر تشريح مجهر ، استخدم زوجا من الملقط الحاد لإزالة الأجنة. احتضان الأجنة المفككة لمدة خمس دقائق على الأقل في محلول عمل ثلاثي الكنائين. ثم استخدم ماصة باستور زجاجية لنقل الجنين المكسورة بأقل قدر من E3 مباشرة إلى أنبوب 50 مليلتر بوزن 45 درجة مئوية من الاغاروز.

قم بإزالة الجنين مع ما يقرب من ملليلتر واحد من الاغاروز المتصاعد وانقل ما يقرب من 100 ميكرولتر من الوسط مع الجنين إلى مركز بئر صغير 10 ملم في قاع طبق بتري زجاجي ذو قاع زجاجي 35 ملم. أثناء إعداد وسط التثبيت ، حرك الجنين إلى حافة دائرة الاغاروز ، بحيث يكون الذيل متجها للخارج. استخدم الإبرة الشعرية لتوجيه الجنين بشكل جانبي قدر الإمكان لتصوير نمو الجسم الخلفي.

ثم مع الشعيرات الدموية ، حافظ على الجنين في الاتجاه الجانبي المطلوب حتى يتم ضبط الجل تماما. بمجرد أن تتماسك قطرة الاغاروز ، استخدم محلول عمل التريكيين لإغراق طبق بتري. بعد ذلك ، تحت مجهر تشريح بقاعدة ضوئية مرسلة ، اضبط موضع المرآة وزاوية الضوء الساقط بحيث يسمح التباين القوي برؤية الجروح في الاغاروز بوضوح.

لإجراء قطع واحد ، استخدم الإبرة الشعرية أو المشرط الصغير لقطع الاغاروز في حركة نشر لأعلى ولأسفل ، بجوار صفار البيض وفي منتصفه ، خلف حقول القلب المكونة أسفل الجسيد الأمامي الخامس ، وبالكامل من خلال الاغاروز إلى الزجاج. أمر بالغ الأهمية هنا للتأكد من عدم تلف الجنين أثناء قطع الاغاروز فوق كيس الصفار. بعد ذلك ، قم بإجراء التخفيضات الثانية والثالثة ، بدءا من الجنين وصولا إلى الزجاج ، عرضية للجسيدات الخمسة الأولى ، مما يسمح بالتكشف الظهري للجسم الخلفي.

بعد ذلك ، بدءا من تقاطع القطعتين الأول والثالث ، قم بعمل قطع قطري بطيء باتجاه نهاية القطع الثالث بينما يرفع ببطء لأعلى لإزاحة مربع الاغاروز المحيط بالجسم الخلفي. باستخدام زوج من الملقط الحاد ، قم بإزالة كتل الاغاروز المخلوع من وسط الجنين باستخدام جدار طبق بتري كدعم أثناء رفع قطع الاغاروز. قبل تركيب العينة ، استخدم 1٪ agarose في E3 لتغطية طبق بلاستيكي مقاس 100 ملم على ارتفاع خمسة ملليمترات والسماح له بالضبط.

ثم ضع قطرة من مليلتر واحد من نقطة الانصهار المنخفضة في وسط الطبق واتركها تتماسك أيضا. قم بتضمين الأجنة في agarose نقطة انصهار منخفضة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. ومع ذلك ، هذه المرة ، قم بإزالة الجنين من أنبوب 50 مليلتر من الاغاروز بقطرة أصغر من المحلول ، وضع هذه القطرة الصغيرة فوق قطرة مليلتر واحدة في وسط الطبق.

استخدم الإبرة الشعرية لوضع الجنين في وسط القطرة الصغيرة والحفاظ على اتجاهه الصحيح حتى يتم ضبط الجل. أخيرا ، استخدم محلول عمل التريكيين لإغراق الطبق وإزالة اللاغاروز الزائد. يظهر في هذا الفيديو المتحرك مثال على جنين سمكة الزرد المحقون بترميز mRNA لبروتين الفلورسنت القابل للتحويل الضوئي kikumeGR ، ثم تم تركيبه في مرحلة 15 جسديا ويخضع لتخيل الفاصل الزمني لمدة 12 ساعة.

يسمح للجسم الخلفي بالتحرك بحرية ويظهر تغيرات مماثلة في التشكل كما هو موضح في الأجنة التي يسمح لها بالتطور خالية من المشيمة في ظروف الثقافة العادية. في هذا الفيديو ، تم حقن الأجنة في مرحلة 16 خلية باستخدام mRNA الذي يشفر هيستون 2BRFP ، الذي يصنف النوى ، و CAAXGFP ، الذي يصنف أغشية الخلايا. تم التقاط الصور على مجهر عمودي متعدد الفوتون بهدف غمر الماء 25X من مرحلة 10 جسيدات لمدة ثلاث ساعات لتصور سلوكيات الخلية أثناء تكوين برعم الذيل.

يمكن رؤية الخلايا تولد نتوءات نشطة وحركة اتجاهية حيث يتشكل برعم الذيل بشكل طبيعي. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم التأكد من أن الجنين في وضع جانبي أثناء تثبيت هلام الاغاروز.

خلاف ذلك ، ستتحرك منطقة الاهتمام بسرعة خارج مجال الرؤية أثناء التصوير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم واضح لكيفية تركيب أجنة الزرد للتصوير الحي لاستطالة الجسم الخلفية.