التلاعب وظيفي من الأم جين المنتجات التي تستخدم في المختبر نضوج البويضة في الزرد

الهدف العام لهذا البروتوكول هو إجراء النضج في المختبر لبويضات أسماك الحمار الوحشي ، وإذا رغبت في ذلك ، للتلاعب الوظيفي بمنتجات جينات الأم ، قبل الإخصاب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي ، المتعلقة بأهمية مساهمة الأم في الجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي زراعة البويضات في المختبر ، تليها الإخصاب وإنتاج أجنة قابلة للحياة.

وإذا رغبت في ذلك ، يسمح بالتلاعب الوظيفي بمنتجات جينات الأم التي تعمل في الجنين المبكر مباشرة بعد الإخصاب. للبدء ، قبل ثمانية إلى 10 أيام من التلاعب بالزراعة في المختبر ، استخدم شبكة صيد لنقل مجموعات متعددة من ذكر واحد وأنثى واحدة من السلالة المطلوبة إلى حوض التزاوج. اتركهم في خزان التزاوج طوال الليل.

بعد السماح للأسماك بالتزاوج خلال فترة ما بعد الظهر التالية ، استخدم شبكة صيد لفصل الإناث التي تنتج البيض أثناء التزاوج ووضعها في حوض منفصل. قم بإطعام هؤلاء الإناث مرتين يوميا بخليط غذائي يحتوي على كمية متساوية تقريبا من الجمبري المالح ورقائق طعام الأسماك. في ظل ظروف معقمة ، أضف 20 مل من L-15 Medium من Leibovitz مع L-glutamine ، PH 7.0 ، إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم استخدم 10 هيدروكسيد الصوديوم العادي لإحضاره إلى درجة الحموضة 9.0. أضف 9 ملليلتر من L-15 Medium إلى أنبوبين مخروطيين منفصلين سعة 50 مل. ثم قم بتسمية أنبوب واحد DHP والآخر DHP.

في أنبوب DHP ، أضف 10 ميكرولتر من DHP ، و 490 ميكرولتر من DH2O ، و 500 ميكرولتر من 10٪ BSA. في أنبوب DHP ، أضف 100 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين ، و 400 ميكرولتر من DH2O ، و 500 ميكرولتر من 10٪ BSA. لإجراء تشريح البويضات ، ابدأ بإعداد محلول مخزون ثلاثي 0.2٪ في DH2O ، مخزن مؤقتا إلى PH 7.0 مع واحد ملي ثلاثي PH 9.0.

احتفظ بهذا الحل عند 4 درجات مئوية. قبل صفر إلى أربع ساعات من نهاية دورة الضوء اليومية في المنشأة ، في دورق سعة 250 مليلتر ، أضف 20 مل من محلول مخزون التريكيين 0.2٪ ، PH 7.0 ، إلى 80 مل من ماء السمك واخلطه. من الأهمية بمكان بدء الإجراء في غضون أربع ساعات من نهاية دورة ضوء النهار التي اعتادت عليها الأسماك.

خلاف ذلك ، لن تنضج البويضات بشكل صحيح. باستخدام ملعقة ، اجمع الأسماك القتل الرحيم من محلول التريكيين ، واشطفها لفترة وجيزة في ماء السمك. ثم ضع السمك على منشفة ورقية لامتصاص الماء الزائد.

استخدم شفرة حلاقة نظيفة لقطع رأس الأسماك القتل الرحيم على مستوى الزعنفة الصدرية. ثم ، باستخدام مقص تشريح ، قم بعمل شق طولي على الجانب البطني من السمكة ، يمتد من الطرف الأمامي إلى منطقة الشرج. ضع السمك على طبق بتري تحت مجهر تشريح مع ضوء ساقط.

بعد ذلك ، باستخدام زوج من ملقط التشريح ، قم بعزل أجزاء المبيض ونقل الأنسجة إلى طبق استزراع 35 × 10 ملم ، يحتوي على أربعة ملليلتر من Leibovitz's L-15 Meidum ، DHP. الآن ، مع تشريح الملقط ، قم بفصل البويضات برفق عن الكتلة الجرابية. قم بفرز البويضات الأربعة في المرحلة المبكرة ، والتي تكون قريبة من الحد الأقصى للحجم ، وتتميز بسيتوبلازم غامق غامق ، وحويصلة جرثومية واضحة بسهولة ، أو GV ، تقع بشكل غير متماثل داخل البويضة.

تخلص من البويضات في المراحل المبكرة ، والبيض الناضج الشفاف في المرحلة 5. استخدم ماصة المراعي الزجاجية لنقل أربع بويضات في المرحلة المبكرة إلى طبق استزراع بلاستيكي ثان مقاس 35 × 10 ملم ، يحتوي على أربعة ملليلتر من L-15 Medium من Leibovitz ، بالإضافة إلى DHP. انقل كميات قليلة من وسط DHP ناقص إلى الطبق ، الذي يحتوي على محلول DHP plus.

في حالة حقن mRNA ، قبل الحقن مباشرة ، استخدم ماء التناضح العكسي بدرجة الحمض النووي الريبي و 0.2 مولار كلوريد البوتاسيوم لتخفيف MRNA إلى محلول نهائي من 0.1 مولار كلوريد البوتاسيوم. في حالة حقن Morpholinos ، أو MOs ، قبل الحقن مباشرة ، قم بتخفيف MOs إلى التركيز المطلوب باستخدام ماء التناضح العكسي من درجة الحمض النووي الريبي ، و 0.2 مولار كلوريد البوتاسيوم ، لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.1 مولار كلوريد البوتاسيوم. بعد ذلك ، لإجراء الحقن ، أمسك البويضات يدويا باستخدام ملقط دقيق ، وباستخدام إبرة مصنوعة من ماصة شعرية زجاجية مسحوبة ، قم بحقن ما يقرب من نانولتر واحد في بويضات المرحلة الرابعة من النوع البري.

استمر في احتضان البويضات غير الناضجة والحقن في وسط DHP عند 26.5 درجة مئوية. فحص كل 30 دقيقة تقريبا للتأكد من بقاء البويضات سليمة ، وتخضع للنضج المناسب ، من خلال أن تصبح شفافة تدريجيا. استخدم ماصة المراعي لإزالة أي بويضات محللة.

وتخلص منها في دورق نفايات المختبر ، للحفاظ على جودة الوسيط. مع ما يقرب من نصف حجم وسط DHP الطازج ، قم بتبادل وسط الاستزراع للحفاظ على محلول واضح ، اعتمادا على كمية تحلل البويضات. عندما تصبح غالبية البويضات شفافة ، ولها GV لم يعد واضحا ، استخدم ملقطا فائق الدقة لإحداث تمزق في الغشاء الجريبي ، في منطقة ذات مساحة متزايدة بين البويضة والغشاء.

انزع جزءا من الغشاء ، وأثناء الضغط باستمرار على الجزء المقشر ، قم بتدوير البويضة من الغشاء. خطوة حاسمة أخرى هي إزالة الغشاء الجريبي. إذا لم تتم إزالة هذه الطبقة بالكامل ، إعاقة الإخصاب وتوسيع المشيمة.

انقل البويضات غير المعطلة بحجم بسيط من الوسط ، إلى طبق بتري مع بضع قطرات من وسط DHP المزروع ، وانتقل إلى الإخصاب. بالقرب من نهاية خطوة نضج البويضة ، وقبل نزع العقل ، قم بإعداد محلول المنوية باستخدام خصيتين من خمسة ذكور في 500 ميكرولتر من محلول هانك. أضف 10 إلى 50 ميكرولتر من محلول المنوية إلى البويضات غير المعطلة في وسط ثقافة DHP.

ثم انتظر 10 ثوان. باستخدام ماصة ، أضف بضع قطرات من وسط E3 إلى البويضات. انتظر دقيقة واحدة ، ثم استخدم وسيط E3 لإغراق اللوحة.

بعد السماح للأجنة المخصبة بالتطور ، استخدم مجهر تشريح مع بصريات ضوئية مرسلة لمراقبة التقدم خلال مراحل الانقسام لضمان الإخصاب الناجح ، كما هو موضح سابقا للتخصيب والتدريج. كما يتضح من التعبير عن GFP ، فإن البويضات من الثقافة المختبرية قادرة على إنتاج البروتين من mRNA الخارجية طوال تطور البويضات في أقل من ساعتين. ومع ذلك ، يمكن أن تتطور البويضات فقط التي تبدأ ظروف الاستزراع في المرحلة الرابعة من تكوين البويضات إلى بويضات ناضجة في المرحلة الخامسة.

في هذه التجربة ، ينقذ الشفق القطبي B mRNA المحقون من النوع البري التأثيرات المظهرية لطفرة في الجين المقابل لها ، الجزيرة الخلوية. يسمح أيضا للأجنة من مجموعة التحكم بالتطور لإظهار النمط الظاهري المتحور المقابل. يمكن لحقن مورفولينو الذي يمنع الترجمة أن ينسخ النمط الظاهري المتحور المعروف بنجاح ، كما هو موضح من خلال حقن lrmp-MO في البويضات ، والذي يحاكي النمط الظاهري المتحور لدورة الطفرة غير المجدية المقابلة.

يمكن أيضا حقن ترميز الرنا المرسال في البويضات البرية أو الطافرة لتصور المنتجات المقابلة داخل الجنين المبكر. على سبيل المثال ، كما هو موضح هنا ، يتم توطين بروتين Sass6-mCherry إلى البؤر المسماة بعلامة الجسيم المركزي Gamma tubulin. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي 5 إلى 6 ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم التسرع في الإجراء ، والسماح بالنضج السليم للبويضات قبل نزع العقل والإخصاب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تثبيت الأجنة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. مثل إنقاذ الجين الذي تهمك ، أو توطين الحمض النووي الريبي أو البروتين.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكوين الأجنة المبكر لاستكشاف مساهمة المنتجات الجينية الأمومية في أسماك الزرد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التلاعب الوظيفي بمنتجات جينات الأم عن طريق النضج في المختبر لبويضات أسماك الحمار الوحشي.