Name: إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: تعلم إعداد العينات البيولوجية السميكة ومراقبتها باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني الناقل الماسح. تتيح هذه الطريقة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع استعادة عمق المجال لدراسة البنية الداخلية للخلايا بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم تمويل هذا العمل من خلال منحتين من ANR (ANR-11-BSV8-016 و ANR-10-IDEX-0001-02). كما نقدر PICT-IBiSA لتوفير الوصول إلى معدات التصوير الكيميائي.

<ol><li>De Rosier, D. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+three+dimensional+structures+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs.</a> Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2491709/">Electron tomography of cells.</a> Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).</li>
<li>Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).</li>
<li>Koguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+STEM+for+observing+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional STEM for observing nanostructures.</a> J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).</li>
<li>Midgley, P. A., Weyland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+electron+microscopy+in+the+physical+sciences%3A+the+development+of+Z-contrast+and+EFTEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).</li>
<li>Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+electron+tomography+of+biological+specimens%3A+Extending+the+limits+of+specimen+thickness+with+bright-field+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging.</a> J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).</li>
<li>Sousa, A. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+STEM+for+the+biological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Development and application of STEM for the biological sciences.</a> Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).</li>
<li>Ercius, P., Muller, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/239633484_Incoherent_Bright_Field_STEM_for_Imaging_and_Tomography_of_Ultra-Thick_TEM_Cross-sections">Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections.</a> Microsc Microanal. 15, (2009).</li>
<li>Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+spreading+and+spatial+resolution+in+thick+organic+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">STEM tomography for thick biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition--a+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Hovden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Crowther+limit%3A+combining+depth-sectioning+and+tilt+tomography+for+high-resolution%2C+wide-field+3D+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions.</a> Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+transmission+electron+microscopy+tilt-+and+focal+series%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series.</a> Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Weyland, M., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://muller.research.engineering.cornell.edu/sites/WEELS/summer06/FEI%20nanoSolutions%20Muller.pdf">Tuning the convergence angle for optimum STEM performance.</a> FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+wavelets+for+extended+depth-of-field%3A+a+new+method+for+the+fusion+of+multichannel+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images.</a> Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).</li>
<li>Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+image+registration+of+electron+tomography+tilt-series%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Marker-free image registration of electron tomography tilt-series.</a> BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).</li>
<li>Messaoudi, C. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ">http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ</a> (2016).</li>
<li>Thevenaz, P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg ">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg </a> (2016).</li>
<li>Forster, B. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/">http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/</a> (2016).</li>
<li>Kohl, L., Bastin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+of+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The flagellum of trypanosomes.</a> Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).</li>
<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+Transmission+Electron+Microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ettention+software+package%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li>
<li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041(2016).</li>
</ol>

ليس لدينا تضارب في المصالح للكشف عنها.

في هذه المقالة، نقدم بروتوكول إعداد نموذج التقليدية جنبا إلى جنب مع دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل 3D على العينات البيولوجية سميكة باستخدام STEM من خلال البؤرية التصوير المقطعي. وقد تم استخدام الراتنج التضمين من العينات البيولوجية لعقود 26، والبروتوكولات البديلة التي يتم تكييفها لأنواع مختلفة من العينات يمكن العثور على طوال الأدب 27. في المقابل، التصوير عينات سميكة في STEM باستخدام طرق من خلال التركيز هو مشروع جديد، وعلى الأرجح أن تتحس...

منذ أوائل 1970s، يقترب التصوير المقطعي في انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) وقد استخدمت على نطاق واسع لتوصيف الهيكلي من العينات البيولوجية 1، 2، 3. كان النداء من التصوير المقطعي الإلكترون أنها يمكن أن تستخدم لدراسة مجموعة واسعة من الهياكل البيولوجية على مقياس متناهي الصغر، من بنية الخلايا والتركيب الدقيق للعضيات لهيكل المجمعات الجزيئات والبروتينات. ومع ذلك، لا يمكن استخدام التصوير المقطعي الإلكترون لدراسة عينات سميكة جدا (أكبر من 0.5 ميكرون). في الواقع، عينات سميكة تنتج الكثير من الإلكترونات المبعثرة، وتوليد منخفضة نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وصور. وبالإضافة إلى ذلك، التصوير المقطعي ينطوي على مجموعة من الصور من العينات يميل، مع سماكة واضح من العينة زيادة مع زاوية الميل. على الرغم من نثر غير مرن يمكن أن تتم تصفيتهخارج باستخدام مرشحات الطاقة، يتم الوصول إلى كمية حرجة من الإلكترونات اللازم للصور SNR عالية بالكاد في تيم. وبالتالي، يكون فقط تم دراسة العينات البيولوجية سميكة باستخدام باجتزاء 4. بعض العينات لا يمكن أن شرائح: البعض قد تتحلل عندما يتم قطع، والبعض الآخر بحاجة إلى أن تدرس في مجملها من أجل فهم تعقيداتها. نهج بديل هو استخدام تيم في وضع 5، 6، 7، 8 المسح الضوئي. في المجهر الإلكتروني النافذ (STEM)، مسار بصري من الإلكترونات وهو يختلف عن ذلك في TEM التقليدية. الالكترونات التي تمر عبر عينة من دون تشتت يمكن جمعها على المحور البصري مع مشرق الميدان (BF) كاشف 9، في حين أن تلك المنتشرة مطاطيا يمكن جمعها في زاوية معينة من المحور البصري مع كاشف الظلام الميدان (DF).ميزة أخرى من STEM هي أن شعاع الالكترون تركيزا يتم فحصه على سطح العينة، مما يساعد على جمع بكسل حسب بكسل للصور. على الرغم من أن شعاع الالكترون يوسع بينما يمر من خلال العينة 10، هذا المخطط مجموعة معينة هو أقل حساسية للإلكترونات المنتشرة inelastically من تيم التقليدية. وعلاوة على ذلك، ليس هناك عدسة بعد العينة في STEM، وبالتالي تجنب الانحرافات اللونية التي يمكن أن تحدث في تيم. طول الكاميرا يمكن تعديلها بحيث كاشف BF بالكشف أساسا الإلكترونات unscattered. باستخدام كاشف DF لدراسة عينات سميكة لا ينصح به بسبب تشتت متعددة، والتي تنتج صورا دقيقة. بدلا من ذلك، كشف BF يمكن استخدام 11. في حين الجذعية يمكن أن تنتج صورا SNR عالية، ولديها منخفض نسبيا العمق من الميدان نظرا للتقارب شعاع عالية نسبيا مقارنة مع تيم، والحد من كمية المعلومات المتعمقة التي يمكن استردادها من سميكةالعينات. في حالة المجهر STEM لتصحيح انحراف، حيث زاوية التقارب يمكن أن تصل إلى 30 مراد، يمكن مجال العمق من تكون منخفضة بما فيه الكفاية بحيث تنبع المعلومات التي هي في التركيز من طائرة الوصل فقط بضعة نانوميتر . إنشاء شعاع الالكترون في وضع مواز يعزز العمق من مجال شعاع الالكترون على حساب القرار 12. ومع ذلك، هذا الإعداد ليس من الممكن دائما. كلما كان ذلك ضروريا لاستخدام شعاع متقاربة الإلكترون، لا بد من استخدام التقنيات التي تعزز العمق من مجال شعاع الالكترون عند دراسة عينات سميكة. وأفادت الدراسات الأخيرة اقتناء صور متعددة في طائرات التنسيق المختلفة في جميع أنحاء عينة لاسترداد أكبر قدر ممكن من المعلومات في التركيز 13 و 14. تصف الدراسات طريقتين مختلفتين للتعامل مع المعلومات من طائرات التنسيق المختلفة. Hovden وآخرون.الجمع في الفضاء فورييه الصور التي تم جمعها في طائرات التنسيق المختلفة، والحصول على إعادة الإعمار النهائي مباشرة من معكوس 3D تحويل فورييه 13. في المقابل، DAHMEN وآخرون. وضع محرك شعاع اعادة الاعمار متقاربة لإعادة بناء في الفضاء الحقيقي حجم 3D من طائرات التنسيق المختلفة 14. وضعت لدينا مختبر أيضا وسيلة لتصوير العينات البيولوجية سميكة. كانت استراتيجيتنا مختلفة من طريقتين المذكورة أعلاه في أننا دمج المعلومات التي هي في التركيز في طائرات التنسيق المختلفة وإعادة بنائها حجم 3D النهائي في الفضاء الحقيقي باستخدام شعاع ضوئي مواز 15. كان هدفنا هو تطوير طريقة التي يمكن أن تتم في أي مختبر المجهر الإلكتروني. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تهدف إلى جمع الصور محورية في كمية محدودة من الوقت، مقارنة الإطار الزمني للتجارب التصوير المقطعي التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا اقتراح طريقة جولد تكييفها للاستخدام مع أنواع مختلفة من التنسيق والبرمجيات إعادة الإعمار. في سياق النشر لدينا من 2015 15، أردنا أن تصور وتميز الانتعاش من العمق من الميدان، لذلك استخدمنا تقارب كبير شبه زاوية من 25 مراد. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لأداء من خلال-تنسيق التصوير في STEM وفقا لطريقة تم تطويرها في المختبر لدينا في عام 2015 15، ونقدم كيف تمت معالجة البيانات من 2015. هذه الطريقة استرداد المعلومات في التركيز من عدة طائرات التنسيق في جميع أنحاء (750 نانومتر) عينة بيولوجية سميكة ويمكن اعادة البناء 3D عالية الجودة. حيثما كان ذلك مناسبا، وتعرض أيضا الاختلافات في هذه المنهجية مقابل الأساليب التي تستخدمها الجماعات الأخرى.

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي مخزن بالفوسفات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>راتنجات الايبوكسي</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P6148</td><td>أضف مسحوق بارافورمالدهايد إلى PBS المسخن عند حوالي 60 درجة مئوية قم بزيادة الأس الهيدروجيني بإضافة 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم حتى لا يظهر مسحوق PFA.</td></tr><tr><td>جلوتارالديهايد</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>أوزميوم رباعي تروكسيد</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات اليورانيل</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>كبسولة الجيلاتين</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>سكاكين التشذيب والهيستو</td><td>LFG توزيع</td><td>سكاكين</td><td></td>الماس الدياتوم</tr><tr><td>المجهري الإلكتروني شبكة النحاس</td><td>LFG توزيع</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>قلم طلاء الشبكة</td><td>LFG Distribution</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>حامل عينة</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>مجهر إلكتروني</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

يصف هذا التقرير بروتوكولا لإعداد عينات بيولوجية سميكة لمزيد من المراقبة باستخدام المجهر الإلكتروني لإرسال الماسح. كما يصف طريقة تصوير لدراسة الهيكل ثلاثي الأبعاد للعينات البيولوجية السميكة عن طريق مسح التصوير المقطعي الإلكتروني المنقول. يعتمد بروتوكول تحضير العينة على الطرق التقليدية التي يتم فيها تثبيت العينة باستخدام عوامل كيميائية ، ومعالجتها بعامل تباين ملح ذرة ثقيلة ، وتجفيفها في سلسلة من حمامات الإيثانول ، وتضمينها في الراتنج. ثم يتم وصف ظروف التصوير المحددة لمراقبة العينات السميكة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني الناقل. تتم ملاحظة أقسام العينة باستخدام طريقة التركيز من خلال التركيز تتضمن جمع عدة صور في مستويات بؤرية مختلفة. يتيح ذلك استعادة المعلومات البؤرية على ارتفاعات مختلفة في جميع أنحاء العينة. يتم تنفيذ نمط التجميع الخاص هذا في كل زاوية ميل أثناء جمع بيانات التصوير المقطعي. ثم يتم إنشاء صورة واحدة ، ودمج المعلومات في التركيز من جميع المستويات البؤرية المختلفة. ثم يتم إنشاء مجموعة بيانات كلاسيكية لسلسلة الإمالة. تتمثل ميزة الطريقة في أنه يمكن إجراء محاذاة سلسلة الإمالة وإعادة البناء باستخدام الأدوات القياسية. تسمح مجموعة الصور البؤرية بإعادة بناء مجلد ثلاثي الأبعاد يحتوي على جميع التفاصيل الهيكلية للعينة قيد التركيز.

في دراستنا، وتسارع الإلكترونات إلى 200 كيلو فولت في انبعاث المجال المجهر انتقال الإلكترون بندقية. وقد تم جمع الصور في وضع STEM BF باستخدام مدة انتظار 20 ميكرو ثانية. وفيما يتعلق تصميم الميل من خلال سلسلة البؤرية، وجدنا أن فترات التركيز من 150 نانومتر أعطى نتائج مرضية لدراسة التركيبية من 750 نانومتر سميكة البيولوجية عينة على الرغم من أن الحقل العمق من شعاع الالكترون كان فقط 3 نانومتر منذ كنا كبيرة جدا تقارب شبه زاوية من 25 مراد. <p class="jove_c...

يصف هذا التقرير بروتوكول تحضير العينة وشروط التصوير المحددة لإجراء التصوير المقطعي الإلكتروني لنقل المسح الضوئي للعينات البيولوجية السميكة.

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع عمق الاسترداد الميداني لعينة بيولوجية سميكة باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني لإرسال الشعاع المتقارب. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية حول التصوير المقطعي الإلكتروني للعينات البيولوجية السميكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على الصور في وضع البت المتقارب ويمكن إجراء معالجة البيانات على معظم البرامج المخصصة للتصوير المقطعي.لبدء تحضير عينة زراعة الخلايا ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 5000 × جم لمدة خمس دقائق. استخدم معلمات الطرد المركزي هذه طوال تحضير العينة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS المخصب بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوترالديهايد.احتضان التعليق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للخليط ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ثلاث مرات بأجزاء ملليلتر واحد من PBS. باستخدام نفس ظروف الحضانة وإجراءات الغسيل ، قم باحتضان الحبيبات في مليلتر واحد من PBS ، المخصب بنسبة 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم ، وفي مليلتر واحد من PBS المخصب بنسبة 2٪ أسيتات اليورانيل.بعد ذلك ، قم بتبريد العينة إلى أربع درجات مئوية. تجفيف الحبيبات عن طريق الحضانات المتتالية في محاليل الإيثانول المركزة بشكل متزايد. الحفاظ على درجة حرارة العينة أربع درجات مئوية طوال فترة الحضانة والطرد المركزي والغسيل.أعد تعليق الحبيبات المجففة في مليلتر واحد من الإيثانول النقي, واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اترك العينة تسخن إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي للعينة. احتضان الحبيبات في محاليل راتنجات الايبوكسي المركزة بشكل متزايد في درجة حرارة الغرفة.بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من راتنجات الايبوكسي النقية ، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للعينة ، وإزالة المادة الطافية ، ثم قم بتعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من راتنجات الايبوكسي والمقسى. انقل المعلق إلى الكبسولة.احتضان الكبسولة البلاستيكية عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لبلمرة الراتنج. قم بإزالة الكبسولة من الحاضنة وتحقق من بلمرة الراتنج. أضف طبقة من راتنجات الايبوكسي والمقسى فوق العينة المدمجة واحتضان الكبسولة مرة أخرى في نفس الظروف.قم بتركيب العينة المضمنة في الراتنج رأسا على عقب في حامل العينة. قم بتثبيت العينة بإحكام على كتلة التشذيب الخاصة بميكروتوم. قطع الكبسولة البلاستيكية بعيدا عن العينة في الراتنج.شكل الراتنج المكشوف في هرم. ثم انقل الكبسولة وحامل العينة إلى الذراع المتحرك للميكروتوم. قم بتثبيت سكين التشذيب واسترشادا بالمجهر ، وصقل شكل الهرم.استبدل سكين التشذيب بسكين النسيج. تحت المجهر ، اضبط زاوية ميل الكبسولة بحيث يكون الهرم عموديا على حافة السكين. اضبط سرعة القطع وقسم العينة.بعد تقسيم العينة ، انقل القسم المختار إلى شبكة نحاسية معالجة فوق ورق الترشيح. اترك العينة تجف ، ثم قم بتحميل العينة في المجهر الإلكتروني. لتصميم سلسلة الإمالة البؤرية ، احسب أولا عمق المجال لحزمة الإلكترون والحد الأقصى للسماكة الظاهرية للعينة.بناء على هذه القيم، حدد فاصل التركيز البؤري وحدد عدد الخطوات البؤرية اللازمة لتصوير العينة بأكملها بأقصى سمك ظاهر. بعد ذلك، عند التكبير المنخفض، حدد موقع منطقة الاهتمام داخل العينة. اضبط الارتفاع المركزي بحيث لا يبدو أن عائد الاستثمار يتحرك عند تدوير العينة.تحقق من أن عائد الاستثمار يظل مرئيا طوال نطاق الإمالة. املأ معلمات سلسلة الإمالة البؤرية لجمع الصور الآلي والحصول على الصور. قم باستيراد سلسلة الصور إلى برنامج معالجة الصور ، وقم بمحاذاة الصور التي تم جمعها بنفس زاوية الميل في التسلسل الهرمي الهرمي.ابحث عن المحاذاة في كل زاوية إمالة عن طريق تكديس الصور المحاذاة. استعرض المكدس للتأكد من أن المنطقة المركزة فقط هي التي تنتقل من صورة إلى أخرى وإعادة محاذاة الصور حسب الحاجة. بمجرد التحقق من المحاذاة في جميع أنحاء العينة، ادمج المعلومات في التركيز البؤري في الإعدادات العالية لإنتاج السلسلة بصورة واحدة لكل زاوية إمالة.قم بإجراء محاذاة البحث عن سلسلة الإمالة بناء على الحد الأدنى المحلي أو العلامات الإيمانية قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد وفحص الصورة الناتجة. إذا بدت إعادة البناء غير واضحة أو مشوهة، فأعد محاذاة سلسلة الصور الأصلية.عينة من t. brucei تم تصويرها وتحليلها باستخدام هذه الطريقة. بزاوية إمالة صفر درجة ، تظهر العديد من تفاصيل جيب السوط.عند زاوية الإمالة الأعلى البالغة 70 درجة ، يتم التركيز على جزء فقط من كل صورة تم جمعها في السلسلة البؤرية. يتغير هذا الموقف طوال السلسلة. من خلال دمج الأقسام في التركيز البؤري ، يتم إنتاج صورة واحدة بمنطقة تركيز أكبر في البؤرة.ويكون هذا التأثير أكثر وضوحا عند تسليط الضوء على مناطق التردد العالي لسلسلة الإمالة البؤرية. تمتد المعلومات عالية التردد إلى معظم الصورة المجمعة ، مما يشير إلى أن سلسلة الإمالة البؤرية قد تمت معالجتها بشكل جيد. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء جزء معالجة الصور في حوالي ثلاث إلى أربع ساعات ، اعتمادا على معلمات المحاذاة وإعادة البناء المختارة.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة إعادة البناء النهائية تعتمد بشكل كبير على جودة اختبارات المحاذاة السابقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء المجموعة ومعالجة الصور لسلسلة الإمالة البؤرية.

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نقدم بروتوكول بشأن كيفية الاستفادة من الإنتاجية العالية التصوير المقطعي البرد الإلكترون لتحديد دقة عالية في هياكل الموقع من الآلات الجزيئية. يسمح البروتوكول كميات كبيرة من البيانات التي سيتم تجهيزها، ويتجنب الاختناقات المشتركة، ويقلل من وقت التوقف عن العمل الموارد، مما يتيح للمستخدم التركيز على المسائل البيولوجية الهامة.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

تقدم هذه الدراسة إجراءات موثوقة وسهلة للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات الدقيقة دون معدات باهظة الثمن في مجهر إلكتروني.

أسلوب للحصول على مقاطع سامسونج المسلسل من الكائنات المجهرية في مجهر إلكتروني

هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

نحن نصف إعداد شرائط من المقاطع التسلسلية وجمعها على دعم نقل كبير لاستخدامها كعينات التصوير المقطعي الصفيف، جنبا إلى جنب مع إجراءات التصوير الآلي في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي. يسمح البروتوكول بفحص واسترجاع وتصوير مستهدف للأحداث المحلية النادرة، والحصول على كميات كبيرة من البيانات.

سير عمل التصوير المقطعي للصفيف للحصول المستهدف على معلومات الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي

استخدام طحن الحزم الأيونية المركزة لإنتاج صفائح زجاجية على الشبكة من العينات البيولوجية المجمدة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد.

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

يتطلب الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد إجراءات اكتساب الصور عالية الإنتاجية. ويرد هنا بروتوكول ينفذ التطورات الأخيرة لاستراتيجيات الاستحواذ المتقدمة التي تهدف إلى تعظيم كفاءة الوقت والإنتاجية لجمع البيانات الطبوغرافية.

استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد

يصف هذا البروتوكول الحصول على بيانات التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون المقطعي عن بعد عالية الدقة باستخدام Tomo5 ومعالجة البيانات اللاحقة والتصوير المقطعي الفرعي باستخدام emClarity. يستخدم Apoferritin كمثال لتوضيح العمليات التفصيلية خطوة بخطوة لتحقيق بنية cryo-ET بدقة 2.86 Å.

التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني جمع البيانات عن بعد ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي

يوفر التصوير المقطعي Cryo-STEM وسيلة لتصور عضيات الخلايا السليمة دون تضمين أو تقسيم أو مستحضرات غازية أخرى. دقة 3D التي تم الحصول عليها حاليا في نطاق بضعة نانومتر ، مع مجال رؤية يبلغ عدة ميكرومتر وسمك يمكن الوصول إليه في حدود 1 ميكرومتر.

تصور العضيات في الموقع عن طريق التصوير المقطعي بالتبريد STEM

يوضح بروتوكول الفيديو هذا كيفية إجراء التصوير المقطعي المجهري الإلكتروني للعينات الفيروسية. للحصول على أفضل النتائج ، يتم تحضير العينات عن طريق التجميد بالضغط العالي واستبدال التجميد اللاحق.

التصوير المقطعي بالفحص المجهري الإلكتروني في علم الفيروسات: التصوير ثلاثي الأبعاد للعينات المجمدة عالية الضغط والاستبدال بالتجميد

نقدم بروتوكول لكيفية جمع ومعالجة الإلكترون البرد tomograms الميتوكوندريا كله. توفر تقنية رؤى تفصيلية في هيكل، وظيفة، وتنظيم مجمعات البروتين غشاء كبيرة في الأغشية البيولوجية الأصلية.

التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

تعلم إعداد العينات البيولوجية السميكة ومراقبتها باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني الناقل الماسح. تتيح هذه الطريقة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع استعادة عمق المجال لدراسة البنية الداخلية للخلايا بدقة عالية.

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

استكشف المزيد من الفيديوهات