إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع عمق الاسترداد الميداني لعينة بيولوجية سميكة باستخدام التصوير المقطعي الإلكتروني لإرسال الشعاع المتقارب. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية حول التصوير المقطعي الإلكتروني للعينات البيولوجية السميكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على الصور في وضع البت المتقارب ويمكن إجراء معالجة البيانات على معظم البرامج المخصصة للتصوير المقطعي.

لبدء تحضير عينة زراعة الخلايا ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 5000 × جم لمدة خمس دقائق. استخدم معلمات الطرد المركزي هذه طوال تحضير العينة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من PBS المخصب بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوترالديهايد.

احتضان التعليق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للخليط ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ثلاث مرات بأجزاء ملليلتر واحد من PBS. باستخدام نفس ظروف الحضانة وإجراءات الغسيل ، قم باحتضان الحبيبات في مليلتر واحد من PBS ، المخصب بنسبة 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم ، وفي مليلتر واحد من PBS المخصب بنسبة 2٪ أسيتات اليورانيل.

بعد ذلك ، قم بتبريد العينة إلى أربع درجات مئوية. تجفيف الحبيبات عن طريق الحضانات المتتالية في محاليل الإيثانول المركزة بشكل متزايد. الحفاظ على درجة حرارة العينة أربع درجات مئوية طوال فترة الحضانة والطرد المركزي والغسيل.

أعد تعليق الحبيبات المجففة في مليلتر واحد من الإيثانول النقي, واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اترك العينة تسخن إلى درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي للعينة. احتضان الحبيبات في محاليل راتنجات الايبوكسي المركزة بشكل متزايد في درجة حرارة الغرفة.

بعد الغسيل النهائي ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من راتنجات الايبوكسي النقية ، واحتضانها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للعينة ، وإزالة المادة الطافية ، ثم قم بتعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من راتنجات الايبوكسي والمقسى. انقل المعلق إلى الكبسولة.

احتضان الكبسولة البلاستيكية عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لبلمرة الراتنج. قم بإزالة الكبسولة من الحاضنة وتحقق من بلمرة الراتنج. أضف طبقة من راتنجات الايبوكسي والمقسى فوق العينة المدمجة واحتضان الكبسولة مرة أخرى في نفس الظروف.

قم بتركيب العينة المضمنة في الراتنج رأسا على عقب في حامل العينة. قم بتثبيت العينة بإحكام على كتلة التشذيب الخاصة بميكروتوم. قطع الكبسولة البلاستيكية بعيدا عن العينة في الراتنج.

شكل الراتنج المكشوف في هرم. ثم انقل الكبسولة وحامل العينة إلى الذراع المتحرك للميكروتوم. قم بتثبيت سكين التشذيب واسترشادا بالمجهر ، وصقل شكل الهرم.

استبدل سكين التشذيب بسكين النسيج. تحت المجهر ، اضبط زاوية ميل الكبسولة بحيث يكون الهرم عموديا على حافة السكين. اضبط سرعة القطع وقسم العينة.

بعد تقسيم العينة ، انقل القسم المختار إلى شبكة نحاسية معالجة فوق ورق الترشيح. اترك العينة تجف ، ثم قم بتحميل العينة في المجهر الإلكتروني. لتصميم سلسلة الإمالة البؤرية ، احسب أولا عمق المجال لحزمة الإلكترون والحد الأقصى للسماكة الظاهرية للعينة.

بناء على هذه القيم، حدد فاصل التركيز البؤري وحدد عدد الخطوات البؤرية اللازمة لتصوير العينة بأكملها بأقصى سمك ظاهر. بعد ذلك، عند التكبير المنخفض، حدد موقع منطقة الاهتمام داخل العينة. اضبط الارتفاع المركزي بحيث لا يبدو أن عائد الاستثمار يتحرك عند تدوير العينة.

تحقق من أن عائد الاستثمار يظل مرئيا طوال نطاق الإمالة. املأ معلمات سلسلة الإمالة البؤرية لجمع الصور الآلي والحصول على الصور. قم باستيراد سلسلة الصور إلى برنامج معالجة الصور ، وقم بمحاذاة الصور التي تم جمعها بنفس زاوية الميل في التسلسل الهرمي الهرمي.

ابحث عن المحاذاة في كل زاوية إمالة عن طريق تكديس الصور المحاذاة. استعرض المكدس للتأكد من أن المنطقة المركزة فقط هي التي تنتقل من صورة إلى أخرى وإعادة محاذاة الصور حسب الحاجة. بمجرد التحقق من المحاذاة في جميع أنحاء العينة، ادمج المعلومات في التركيز البؤري في الإعدادات العالية لإنتاج السلسلة بصورة واحدة لكل زاوية إمالة.

قم بإجراء محاذاة البحث عن سلسلة الإمالة بناء على الحد الأدنى المحلي أو العلامات الإيمانية قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد وفحص الصورة الناتجة. إذا بدت إعادة البناء غير واضحة أو مشوهة، فأعد محاذاة سلسلة الصور الأصلية.

عينة من t. brucei تم تصويرها وتحليلها باستخدام هذه الطريقة. بزاوية إمالة صفر درجة ، تظهر العديد من تفاصيل جيب السوط.

عند زاوية الإمالة الأعلى البالغة 70 درجة ، يتم التركيز على جزء فقط من كل صورة تم جمعها في السلسلة البؤرية. يتغير هذا الموقف طوال السلسلة. من خلال دمج الأقسام في التركيز البؤري ، يتم إنتاج صورة واحدة بمنطقة تركيز أكبر في البؤرة.

ويكون هذا التأثير أكثر وضوحا عند تسليط الضوء على مناطق التردد العالي لسلسلة الإمالة البؤرية. تمتد المعلومات عالية التردد إلى معظم الصورة المجمعة ، مما يشير إلى أن سلسلة الإمالة البؤرية قد تمت معالجتها بشكل جيد. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء جزء معالجة الصور في حوالي ثلاث إلى أربع ساعات ، اعتمادا على معلمات المحاذاة وإعادة البناء المختارة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة إعادة البناء النهائية تعتمد بشكل كبير على جودة اختبارات المحاذاة السابقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء المجموعة ومعالجة الصور لسلسلة الإمالة البؤرية.