تصور التفاعل البروتين البروتين في هيولي النووية والكسور بواسطة شركة مناعي و في الموقع القرب من ربط الفحص

الهدف العام من هذه التجربة هو مقارنة مزايا وعيوب الترسيب المناعي المشترك ، أو co-ip ، ومقايسة ربط القرب ، أو PLA ، في تصور تفاعلات البروتين البروتيني في مقصورات خلوية مختلفة. يمكن أن تساعد المقارنة المعروضة هنا بين طريقتين مختلفتين العلماء على تحديد أيهما أكثر ملاءمة لغرضهما المحدد عند التحقيق في أنماط توزيع تفاعلات بروتين البروتين في النواة وسيتوبلازم الخلية. الميزة الرئيسية ل co-ip هي اكتشاف تفاعلات البروتين البروتين الأصلية.

على النقيض من ذلك ، فإن فائدة PLA هي تحليل تفاعلات البروتين البروتيني بطريقة سريعة على مستوى الخلية الواحدة. بعد زراعة وحصاد خلايا hex293 وفقا لبروتوكول النص ، إلى 3 مرات 10 إلى الخلايا السادسة ، أضف 300 ميكرولتر من محلول الاستخراج السيتوبلازمي البارد ، وقم بتدوير الخلايا بأعلى سرعة لمدة 15 ثانية. احتضان المستخلص على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وكل 10 دقائق أثناء الحضانة ، قم بدوامة العينة لمدة خمس ثوان.

ثم أضف 16.5 ميكرولتر من محلول الاستخراج السيتوبلازمي البارد ، والدوامة لمدة خمس ثوان ، واحتضان العينة على الجليد لمدة خمس دقائق. دوامة المستخلص لمدة خمس ثوان والطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد مبرد مسبقا واحتفظ بها على الجليد حتى الاستخدام ، ثم استخدم ملليلترا واحدا من PBS البارد لغسل الكريات غير القابلة للذوبان ثلاث مرات عن طريق سحب الكريات لأعلى ولأسفل وإزالة PBS بعد كل غسلة.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الاستخراج النووي البارد ، والدوامة لمدة 15 ثانية ، واحتضن على الجليد لمدة ساعة واحدة. كل 10 دقائق أثناء الحضانة ، قم بتدوير العينة لمدة 15 ثانية ، واستخدم طرف 200 ميكرولتر لماصة المحلول 10 مرات. قم بتدوير الأنبوب لمدة 15 ثانية ، وقم بالطرد المركزي للعينة عند 16،000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية التي تحتوي على المستخلص النووي إلى أنبوب جديد مبرد مسبقا واحتفظ بها على الجليد حتى الاستخدام.

قم بإزالة 10٪ من حجم المستخلصات النووية والسيتوبلازمية كمدخلات ، ثم أضف PBS البارد إلى المستخلصات المتبقية إلى الحجم النهائي البالغ مليلتر واحد. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام. بعد التنظيف المسبق للخرز المغناطيسي المترافق بالبروتين g إذا لزم الأمر ، اجمع بين 40 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المترافق بالبروتين g مع أربعة ميكروغرامات من الجسم المضاد السريع متعدد النسيلة المضاد ل RBM3 ، أو IGG السريع كعنصر تحكم سلبي في 200 ميكرولتر من PBST.

احتضن ما يصل إلى درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير لمدة 40 دقيقة. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي ، ثم قم بإزالة الغطاء الخاضع للتغليف والتخلص منه. ثم باستخدام 200 ميكرولتر من PBST ، اغسل الخرز مرة واحدة.

أضف ملليلترا واحدا من الليزات المخففة إلى الخرزات ، واحتضن على دوار عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي واستنشق السوبرناتينت. أضف 0.5 مل من PBST إلى الخرز ، واغسلها ثلاث مرات على دوار عند أربع درجات مئوية ، بسرعة ثابتة تبلغ 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة البروتين من الخرزات بإضافة 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة ، ثم قم بتسخين العينة على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تدوير الخرزات ، انقل السائل إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. لإجراء كيمياء الخلايا المناعية ، قم بزرع خلايا HEK293 في 1.5 في 10 إلى الخلايا الأربع لكل غرفة في شريحة مطلية بثماني غرف بوليديلسين.

في 0.4 ملليلتر من DMEM مكمل مع 10٪ FPS و 100 وحدة لكل مليلتر من pentrep. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة ، ثم استنشق الوسط واستخدم 4٪ PFA لتثبيت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في غطاء التدفق الرقائقي. ثم استنشق PFA واستخدم 0.5 مل من PBS لكل غرفة لغسل الخلايا ثلاث مرات.

أضف 0.5٪ tritonX100 مع 5٪ NGS و PBS لاختراق الخلايا وسدها واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، بعد تخفيف الأجسام المضادة الأولية متعددة النسيلة المضادة ل NF90 ومضادة ل RBM3 من واحد إلى 100 ، أضف الأجسام المضادة الأولية إلى الآبار واحتضانها على شاكر عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم 0.5 مل من PBS لغسل الغرف ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.

لإجراء كيمياء الخلايا المناعية ، أضف مخففا واحدا إلى 500 من صبغة الفلورسنت الخضراء المقترنة بصبغة الفلورسنت الحمراء المقترنة بالأجسام المضادة للأرانب إلى الخلايا ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أضف واحدا إلى 5 ، 000 تخفيف من DAPHE NBPS لمواجهة تلطيخ النوى واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم اغسل العينات باستخدام PBS كما كان من قبل. قم بإزالة الغرف من الشريحة الزجاجية وجففها ، قبل استخدام 250 ميكرولتر من وسط التركيب لكل شريحة لتركيبها.

لإعداد مجسات فحص ربط القرب الأنبوبي ، بعد احتضان الخلايا والأجسام المضادة الأولية ، والغسيل كما هو موضح للتو ، قم بتخفيف المجسات المعدة مسبقا من واحد إلى 5 في 0.1٪ tritonx100 و 5٪ NGS و PBS ، بحجم إجمالي قدره 320 ميكرولتر لشريحة واحدة من ثماني غرف. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة الغرف من الجانب الزجاجي وأضف المجسات المخففة ، ثم احتضن الغرف في حاضنة رطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

قم بإعداد محلول ربط عن طريق خلط ثمانية ميكرولترات من الليغاز ، و 64 ميكرولترا من مخزون الربط 5x ، و 248 ميكرولتر من الماء. اضغط على السائل من الشريحة ، واستخدم مخزن غسيل onex A لغسل العينات مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. أضف محلول الربط إلى العينات ، واحتضنها في حاضنة رطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بإعداد محلول التضخيم عن طريق خلط أربعة ميكرولترات من البوليميراز ، و 64 ميكرولتر من مخزون التضخيم 5x ، و 252 ميكرولتر من الماء ، ولف الأنبوب بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. بعد ذلك ، اضغط على السائل من الشريحة ، واستخدم مخزن غسيل x A لغسل العينات مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما. أضف محلول التضخيم إلى العينات واحتضنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة داكنة لمدة 100 دقيقة.

ثم بعد النقر على السائل كما كان من قبل ، اغسل العينات مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها في مخزن الغسيل B قبل غسلها مرة واحدة في 0.1 × مخزن مؤقت للغسيل B. أخيرا ، جفف الشريحة وقم بتركيب العينات ب 250 ميكرولتر من وسط التثبيت التجاري باستخدام DAPHE ، وافحص الفلور تحت المجهر ، واحصل على صور بكاميرا CCD. كشفت تجارب الترسيب المناعي المشترك مع RBM3 كبروتين الطعم أن تفاعلات NF90-RBM3 موجودة في الغالب في النواة وتوجد أقلية في السيتوبلازم. في تجربة التآكل المناعي هذه ، يظهر كل من NF90 و RBM3 في النواة.

تم العثور على كلا البروتينين أيضا في السيتوبلازم في C2 ، ويظهر كلا البروتينين توضعا مثاليا في كل حجرة. كما هو موضح في هذه الصور ، كشف مقايسة ربط القرب عن نمط تفاعلات NF90-RBM3 ، والتي تشبه إلى حد بعيد الكيمياء المناعية التقليدية ، والتي تتفاعل معظم التفاعلات في النواة في غالبية الخلايا. أظهرت نسبة صغيرة فقط من الخلايا في الغالب توزيعا سيتوبلازميا لتفاعلات NF90-RBM3.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه على الرغم من أنه أكثر ملاءمة ، إلا أن PLA لا يعكس تفاعلات البروتين بشكل مباشر. بدلا من ذلك ، يكتشف co-ip التفاعل الموجه. بالإضافة إلى ذلك ، تحدد خصوصية الجسم المضاد الأساسي جودة النتيجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار طريقة مناسبة لدراسة تفاعلات بروتين البروتين في مقصورات خلوية مختلفة وفقا لغرضك التجريبي.