وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران

حقن سوبريتينال قد طبقت على نطاق واسع في الدراسات الإكلينيكية للعلاج باستبدال الخلايا الجذعية لكبر السن البقعي. في هذه المقالة تصور، يصف لنا تقنية حقن سوبريتينال أقل مخاطرة واستنساخه وتعديل التحديد عن طريق نهج ترانس-سكليرال لتوصيل الخلايا إلى عيون الفئران.

الهدف العام من هذا الفيديو هو تقديم تقنية حقن تحت الشبكية عبر الصلبة القابلة للتكرار لتوصيل الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية البشرية ، أو الخلايا RPE ، إلى الفضاء تحت الشبكية لعيون القوارض مع الحد الأدنى من خطر تلف الشبكية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء شق صغير أولا في الملتحمة الصدغية الخلفية للطرف لفضح الصلبة الأساسية. بعد ذلك ، يتم استخدام إبرة الأنسولين المشطوفة عيار 31 لاختراق مركب قلب الصلبة عن طريق إدخال الإبرة 500 ميكرون أو ما يقرب من نصف الطرف في الأنسجة مع توجيه الجانب المشطوف لأعلى لإنشاء ثقب تجريبي.

بعد ذلك ، يتم توجيه إبرة حقن مشطوفة عيار 33 متصلة بحقنة في الفتحة التجريبية وإدخالها بزاوية وعمق محددين ، وتغلق فتحة الحقن الذاتية بعد سحب الإبرة ولا حاجة إلى غرزة أو غراء الأنسجة. تتكون اعتلالات الشبكية التنكسية من مجموعة واسعة من الأمراض التي تنطوي على أنواع مختلفة من خلايا الشبكية. يحدث المرض الأكثر شيوعا في جميع أنحاء العالم ، وهو التنكس البقعي المرتبط بالعمر ، أو AMD ، بين كبار السن ويؤدي إلى العمى الدائم.

تتضمن التغيرات المرضية التي تحدث في AMD تنكس أولي للخلايا الظهارية المصطبغة في الشبكية ، أو RPE. يؤدي فقدان RPE إلى خلل في مستقبلات الفلور في الشبكية أو الموت. تقتصر العلاجات الدوائية الحالية للمرحلة المبكرة من AMD على إبطاء التقدم أو تخفيف الأعراض.

هذا إلى جانب القدرة التجديدية المحدودة لشبكية العين يعني أنه لا يوجد علاج فعال لاستعادة الرؤية. حدد معهد الخلايا الجذعية العصبية مؤخرا مجموعة من الخلايا الجذعية البالغة في مجموعة خلايا RPE. يمكن استخدام هذه الخلايا كمصدر للعلاج ببدائل الخلايا الجذعية.

يجري معهدنا حاليا دراسات ما قبل السريرية للتحقيق في فعالية وسلامة علاج زرع الخلايا الجذعية RPE في نموذج حيواني للفئران التنكسية RPE. في هذه الدراسة ، نستخدم تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة لتوصيل الخلايا الجذعية RPE إلى عيون الفئران ، بين طبقات الشبكية و RPE. طريقتنا هي وسيلة سهلة وموثوقة للتسليم الناجح للخلايا إلى الفضاء تحت الشبكية.

ستحتاج إلى الكواشف والمعدات التالية. 1٪ تروبيكاميد و 2.5٪ فينيليفرين ، مصنوعة حديثا من 10٪ فينيليفرين ، عن طريق تخفيفها في محلول ملحي معقم 0.9٪ في يوم الجراحة ، تستخدم لتوسيع حدقة العين. يستخدم غسول العين لشطف العين والحفاظ على رطوبة العين غير الجراحة.

يستخدم زيت تشحيم العين للحفاظ على رطوبة العين اليمنى غير الجراحية أثناء الجراحة. يستخدم 0.5٪ بروباراكايين كمخدر موضعي. يتم استخدام زيوت تشحيم العين على العين اليسرى التي يتم تشغيلها أثناء فحص OCT.

هناك حاجة إلى الحد الأدنى من المواد والمعدات لهذه التقنية. يتم توضيح معلومات مفصلة عن المعدات والكواشف المستخدمة في هذه التقنية في البروتوكول. يتم استخدام حقنة سعة 10 ميكرولتر لحقن الخلايا.

قبل الحقن ، نقوم أولا بتجميع الحاقن وتعقيمه بالإيثانول. أدخل إبرة معقمة مشطوفة قياس 33 في المحقنة وقم بلفها بإحكام لتجميع الحاقن. اغسل الحاقن بنسبة 100٪ من الإيثانول ، ثم 70٪ من الإيثانول ، ثم الماء المقطر منزوع الأيونات ، بالتتابع لمدة خمس إلى ست مرات لكل منهما.

ضع علامة على إبرة الحاقن بقلم تحديد أسود معقم في موضع 600 ميكرون بعيدا عن طرف الإبرة. ضع الحاقن على مناور دقيق لاستخدام الحقن. يتم تحضير خلايا RPE البشرية في يوم الجراحة وحفظها في خليط الماء المثلج.

قم بعمل تعليق الخلية برفق وتحميل الحاقن ب 1.2 ميكرولتر ، ويتم استخدام 0.2 ميكرولتر إضافي للتعويض عن التدفق العكسي للحقن ، لضمان حجم حقن ميكرولتر واحد. استبدل الحاقن المملوء بتعليق الخلية على المعالج الدقيق ، أو اطلب من مساعد حمله عموديا ، حيث تميل خلايا RPE إلى الغرق بسهولة في المحاليل. جهز المنطقة الجراحية المعقمة عن طريق وضع وسادة جراحة معقمة مع وسادة تدفئة تحتها على مسرح المجهر التشريح.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة ولاية نيويورك في ألباني. قم بوزن وتخديره باستخدام نظام توصيل بخار الأيزوفلوران كما هو موضح هنا. انقل الجرذ إلى منطقة الجراحة بمجرد تخديره ، وضعه في مخروط أنف متصل بنظام الأيزوفلوران للحفاظ على التخدير.

قم بتغطية جسم الجرذ بالشاش ، واضغط على إصبع قدم الجرذ لتأكيد التخدير الكامل. ضع قطرة من زيوت التشحيم على العين اليمنى للفأر ، ضع الجرذ على جانبه الأيمن ، مع مواجهة عينه اليسرى للسقف للحقن ، ورأسه باتجاه اليد اليمنى للجراح ، والعودة نحو الجراح. قم بقص أي شعيرات تغطي العين.

قم بتقطير كمية صغيرة من غسول العين للجانب الصدغي من العين اليسرى ، واجمع الفائض في جانب الأنف باستخدام قضيب قطني لشطف العين. قم بتوسيع التلميذ باستخدام 1٪ تروبيكاميد ، 2.5٪ فينيليفرين ، لإجراء التصوير المقطعي البصري بعد الحقن ، أو فحص OCT ، عن طريق تطبيق قطرة واحدة من كل منهما. ضعي قطرة من غسول العين للحفاظ على رطوبة العين.

ضعي قطرة من Proparacain على العين وأزيلي الفائض باستخدام قضيب قطني. قم بتدليك الجلد المحيط بالعين بلطف أربع إلى ست مرات لفتح الجفن ، بحيث تخرج العين مؤقتا وقليلا من تجويفها للسماح بالوصول السهل إلى إبرة الحاقن. استخدم القوى لإمساك الملتحمة الخلفية للطرف ، وقم بتدوير العين للعثور على مكان أفضل للجراحة دون الإضرار بعضلات العين.

ارفع الملتحمة برفق لعمل خيمة ، وقم بتدوير العين عن طريق الأنف. ثم استخدم المقص لقطع الجزء العلوي من الخيمة ، لعمل فتحة صغيرة في الملتحمة وفضح الصلبة. بعد ذلك ، استخدم الملقط للإمساك بحافة فتحة الملتحمة بجوار الحافة ، وقم بتدوير العين عن طريق الأنف ، بحيث يكون محور الحدقة بزاوية حوالي 30 درجة بالنسبة للأرض.

يتم استخدام إبرة الأنسولين المعقمة ذات القياس 31 لاختراق مركب قلب الصلبة مع وضع شطبة تشير إلى أعلى ونصف الحافة ، أو حوالي 500 ميكرون يتم إدخالها في الأنسجة ، لإنشاء ثقب تجريبي للحقن. اسحب إبرة الأنسولين بعناية ، ويمكن رؤية انصباب صغير للدم. يمكن وضع رمح العين لتنظيف الثقب ووقف النزيف إذا لزم الأمر.

قم بتوجيه إبرة الحاقن المحملة بخلية RPE في الفتحة التجريبية بزاوية حوالي 10 إلى 15 درجة بالنسبة للسطح المحلي للصلبة للوصول إلى مساحة تحت الشبكية عن طريق إدخال الإبرة بطول 500 ميكرون بالكامل في الأنسجة وترك مسافة 100 ميكرو بين النقطة الموجودة على الإبرة التي تغطيها الأنسجة ونقطة العلامة السوداء على الإبرة. أخبر المساعد بالضغط على مكبس المحقنة ، لحقن الحجم المناسب من الخلايا. أمسك الحاقن في مكانه لمدة 25 إلى 30 ثانية بعد الحقن، ثم اسحب الحاقن ببطء.

إغلاق ثقب الحقن تلقائيا ، ويلاحظ بشكل شائع كمية صغيرة تبلغ حوالي 0.2 ميكرولتر من التدفق العكسي. اشطف موقع الحقن بغسول العين المعقم ثلاث مرات ، واجمع الفائض باستخدام قضيب قطني. ضع قطرة من مادة التشحيم على العين التي تم تشغيلها ، وانقل الجرذ إلى محطة OCT ، لفحص موقع الخلايا المزروعة ، وحجم الفقاعة تحت الشبكية.

أعد الجرذ إلى قفص الاسترداد تحت مصباح حراري للحفاظ على درجة حرارة جسمه بمجرد الانتهاء من OCT. راقب الفئران للتأكد من خروجه من التخدير ، وراقب يوميا أي علامات للضيق. أبلغ الطبيب البيطري على الفور إذا كانت هناك مخاوف.

باستخدام تقنيتنا ، قمنا بتوصيل خلايا RPE البشرية باستمرار ونجاح إلى الفضاء تحت الشبكية. مباشرة بعد الزرع ، أجرينا فحص OCT لمراقبة موقع الحقن والفقاعة تحت الشبكية التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا المزروعة. هذا بمثابة أداة فحص جيدة لتقييم جودة الحقن ودرجة تلف الشبكية أو النزيف.

يمكن رؤية انعكاس الضوء الساطع حول موقع الحقن وفقاعة تحت الشبكية مملوءة بتعليق الخلية تحت فحص OCT. لا يوجد نزيف أو تسرب للسوائل بين العينين أو انفصال الشبكية ، يظهر حول موقع الحقن أو الفضاء داخل الجسم الزجاجي في الحقنة الناجحة ، مما يدل على الحد الأدنى من الصدمة الناجمة عن الحقن. تم نواة عيون الفئران التي تم تشغيلها وتثبيتها وتقطيعها لتحليل الأنسجة المناعية بعد سبعة أيام من الزرع.

استخدام العلامة النووية البشرية ، Hunu ، وعلامة خلية RPE ، OTX2 ، للكشف عن الخلايا المزروعة. أظهر البيان الإيجابي لكلتا العلامتين أن خلايا RPE البشرية المزروعة كانت موجودة في الفضاء تحت الشبكية لعيون الفئران. تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة بسيطة وسهلة التعلم.

يسبب صدمة أقل للجراحة ويترك شبكية العين سليمة عن طريق تمرير إبرة الحقن عبر الطبقات الخارجية لجدار العين ، دون كسر الشبكية العصبية. تسمح القطرات الكمية للإبرة التجريبية وإبرة الحقن بالدخول إلى الأنسجة والزاوية المستخدمة أثناء الحقن بتوصيل الخلايا بشكل موثوق إلى الفضاء تحت الشبكية بدقة ومعدل نجاح أعلى بكثير. باستخدام طريقة الحقن هذه ، قمنا باستمرار ونجاح بتسليم خلايا RPE الجذعية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية لفئران RCS.

يمكن تكرار هذا الإجراء بسهولة من قبل أي شخص يشاهد الفيديو.