عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا اللحمية الوسيطة من أربعة مصادر مميزة للأنسجة في الفترة المحيطة بالولادة ، وبطانة الحبل السري ، وهلام وارتون ، وتقاطع الحبل والمشيمة ، والمشيمة الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تطوير مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب البديل من خلال الحصول على خلايا جذعية وسيطة عالية الجودة ، بشكل غير جراحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج بشكل منتج أعدادا كبيرة من مجموعات الخلايا المتجانسة عالية الجودة من مصادر الأنسجة المتميزة في الفترة المحيطة بالولادة.

يمكن استخدام الخلايا اللحمية اللحمية المتوسطة متعددة الأشكال المشتقة من هذه التقنية لعلاج الأمراض والاضطرابات المختلفة لأنها أكثر بدائية من الخلايا الجذعية الوسيطة المعزولة من الأنسجة البالغة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصائص الخلايا اللحمية الوسيطة من أجزاء مختلفة ومنافذ محددة من الحبل السري والمشيمة. ابدأ بوضع العينة في طبق بتري مقاس 150 ملم على الثلج في خزانة أمان حيوية واستخدم إبرة وحقنة لشطف الأنسجة عدة مرات باستخدام PBS المثلج.

عند إزالة جميع الجلطات الدموية ، افحص العينة بعناية لتحديد المناطق التشريحية المختلفة. ثم استخدم الملقط لإمساك الطرف الجنيني للحبل السري واستخدم المقص لعمل شق بعناية في الجزء العلوي من تقاطع الحبل والمشيمة. قم بعمل شق ثان أسفل الوصلة لفصل تقاطع الحبل والمشيمة عن المشيمة.

وتقسيم الأنسجة المنفصلة إلى أطباق بتري فردية. بعد ذلك ، قم بقطع الحبل السري طوليا لكشف الأوعية الدموية وهلام وارتون المحيط تماما دون إزعاج الظهارة. استخدم مشرطا لكشط هلام وارتون بعيدا عن الأوعية الدموية والظهارة في السببمينيون.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأوعية الدموية ، ونقل أي هلام حول الأوعية الدموية المتبقي تحت الأوعية الدموية وحولها إلى طبق جيلي وارتون وضع أنسجة بطانة الحبل السري المتبقية في طبقها الخاص. عندما يتم تشريح جميع الأنسجة ، استبدل PBS في كل طبق بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من التربسين واستخدم المقص لتقطيع كل عينة من الأنسجة إلى قطعة من واحد إلى ملليمترين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. استخدم مجهر تباين الطور لمراقبة الهضم الجزئي من خلال تصور إطلاق الخلايا من الأنسجة.

في نهاية فترة الهضم الجزئي ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من وسط الثقافة ونقل العينات إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مل. اترك قطع المناديل تستقر لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وقم بلوحة من 15 إلى 20 قطعة من الأنسجة المهضومة جزئيا لكل عينة في قوارير فردية لزراعة الأنسجة بحجم 75 سم مربع.

بعد ذلك ، أضف تسعة ملليلتر من وسط الاستزراع لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير وسط المزرعة بعد ثلاثة أيام وفحص النباتات xplants عن طريق الفحص المجهري الطور لنمو الخلايا. عندما يصل نمو الخلية إلى 70 في المائة من التقاء ، قم بفصل الخلايا في واحد إلى ملليلتر من محلول التربسين لكل قارورة ، وقم بتدوير القارورة للحصول على طلاء متساو بمحلول الإنزيم واحتضان المزارع لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية.

ثم قم بتحييد التفاعل بمقدار واحد إلى ملليلتر من وسط الاستزراع. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع للزراعة الفرعية بكثافة بذر واحد في عشرة إلى أربع خلايا لكل سنتيمتر مربع من البذر. تظهر الخلايا من بطانة الحبل ومزارع الهلام في وارتون قيم كفاءة مستعمرة تبلغ 59 و 80 مستعمرة على التوالي.

ومع ذلك ، فإن قيمة الكفاءة التي تشكل المستعمرة لخلايا تقاطع الحبل والمشيمة تشبه تلك التي لوحظت للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظام مما يشير إلى أن الخلايا المشتقة من تقاطع الحبل والمشيمة تتمتع بقدرات تكاثرية وتجديد ذاتي أعلى. يشير جانب التدفق إلى التحليل المتري لمعلقات الخلية المفردة المعزولة من أنسجة الفترة المحيطة بالولادة أن النسب المئوية للخلايا الإيجابية لعلامات الخلايا الجذعية الوسيطة المحددة من جميع مصادر الأنسجة الأربعة مماثلة لتلك التي تعبر عنها الخلايا الوسيطة القياسية المشتقة من نخاع العظام. ومع ذلك ، فإن متوسط نسب شدة الفلور يشير إلى أن الخلايا المشتقة من هلام وارتون ووصلة الحبل والمشيمة متشابهة جدا أو أعلى من بطانة الحبل في الخلايا المشتقة من المشيمة الجنينية.

ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من اختلاف قيم كفاءة تشكيل المستعمرة ، فإن جميع الخلايا من مصادر الفترة المحيطة بالولادة المختلفة تعبر عن مستويات متشابهة من علامات تعدد القدرات عن طريق تحليل RTPCR الكمي باستثناء الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقة من تقاطع الحبل والمشيمة ، والتي عبرت عن أعلى مستويات التعبير لجميع علامات تعدد القدرات المختبرة. علاوة على ذلك ، تتمايز الخلايا اللحمية الوسيطة المعزولة من جميع مصادر الفترة المحيطة بالولادة بسهولة إلى أنواع الخلايا الشحمية والغضروفية والعظمية بالإضافة إلى التمايز الثلاثي المثبت. على الرغم من أن إمكانات التمايز تختلف وفقا لمصدر الخلايا اللحمية الوسيطة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بكفاءة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ممارسة التقنية الجانبية وتجنب التلوث المتبادل بين مصادر الأنسجة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف طبيعة منافذ الخلايا الجذعية في أنسجة الفترة المحيطة بالولادة.