عزل وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية من الحبل السري البشري والجنين المشيمة
أبريل 3, 2017
هنا، نقدم بروتوكول لتشريح الحبل البشري السري (UC) والجنين عينة المشيمة إلى الحبل التبطين (CL)، وهلام وارتون (WJ)، الحبل السري المشيمة تقاطع (CPJ)، والمشيمة الجنين (FP) لعزل وتوصيف الخلايا اللحمية الوسيطة (اللجان الدائمة) باستخدام تقنية ثقافة يزدرع.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا اللحمية الوسيطة من أربعة مصادر مميزة للأنسجة في الفترة المحيطة بالولادة ، وبطانة الحبل السري ، وهلام وارتون ، وتقاطع الحبل والمشيمة ، والمشيمة الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تطوير مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب البديل من خلال الحصول على خلايا جذعية وسيطة عالية الجودة ، بشكل غير جراحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج بشكل منتج أعدادا كبيرة من مجموعات الخلايا المتجانسة عالية الجودة من مصادر الأنسجة المتميزة في الفترة المحيطة بالولادة.
يمكن استخدام الخلايا اللحمية اللحمية المتوسطة متعددة الأشكال المشتقة من هذه التقنية لعلاج الأمراض والاضطرابات المختلفة لأنها أكثر بدائية من الخلايا الجذعية الوسيطة المعزولة من الأنسجة البالغة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لخصائص الخلايا اللحمية الوسيطة من أجزاء مختلفة ومنافذ محددة من الحبل السري والمشيمة. ابدأ بوضع العينة في طبق بتري مقاس 150 ملم على الثلج في خزانة أمان حيوية واستخدم إبرة وحقنة لشطف الأنسجة عدة مرات باستخدام PBS المثلج.
عند إزالة جميع الجلطات الدموية ، افحص العينة بعناية لتحديد المناطق التشريحية المختلفة. ثم استخدم الملقط لإمساك الطرف الجنيني للحبل السري واستخدم المقص لعمل شق بعناية في الجزء العلوي من تقاطع الحبل والمشيمة. قم بعمل شق ثان أسفل الوصلة لفصل تقاطع الحبل والمشيمة عن المشيمة.
وتقسيم الأنسجة المنفصلة إلى أطباق بتري فردية. بعد ذلك ، قم بقطع الحبل السري طوليا لكشف الأوعية الدموية وهلام وارتون المحيط تماما دون إزعاج الظهارة. استخدم مشرطا لكشط هلام وارتون بعيدا عن الأوعية الدموية والظهارة في السببمينيون.
بعد ذلك ، قم بإزالة الأوعية الدموية ، ونقل أي هلام حول الأوعية الدموية المتبقي تحت الأوعية الدموية وحولها إلى طبق جيلي وارتون وضع أنسجة بطانة الحبل السري المتبقية في طبقها الخاص. عندما يتم تشريح جميع الأنسجة ، استبدل PBS في كل طبق بثلاثة إلى خمسة ملليلتر من التربسين واستخدم المقص لتقطيع كل عينة من الأنسجة إلى قطعة من واحد إلى ملليمترين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. استخدم مجهر تباين الطور لمراقبة الهضم الجزئي من خلال تصور إطلاق الخلايا من الأنسجة.
في نهاية فترة الهضم الجزئي ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من وسط الثقافة ونقل العينات إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مل. اترك قطع المناديل تستقر لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بشفط المادة الطافية بعناية وقم بلوحة من 15 إلى 20 قطعة من الأنسجة المهضومة جزئيا لكل عينة في قوارير فردية لزراعة الأنسجة بحجم 75 سم مربع.
بعد ذلك ، أضف تسعة ملليلتر من وسط الاستزراع لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير وسط المزرعة بعد ثلاثة أيام وفحص النباتات xplants عن طريق الفحص المجهري الطور لنمو الخلايا. عندما يصل نمو الخلية إلى 70 في المائة من التقاء ، قم بفصل الخلايا في واحد إلى ملليلتر من محلول التربسين لكل قارورة ، وقم بتدوير القارورة للحصول على طلاء متساو بمحلول الإنزيم واحتضان المزارع لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية.
ثم قم بتحييد التفاعل بمقدار واحد إلى ملليلتر من وسط الاستزراع. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع للزراعة الفرعية بكثافة بذر واحد في عشرة إلى أربع خلايا لكل سنتيمتر مربع من البذر. تظهر الخلايا من بطانة الحبل ومزارع الهلام في وارتون قيم كفاءة مستعمرة تبلغ 59 و 80 مستعمرة على التوالي.
ومع ذلك ، فإن قيمة الكفاءة التي تشكل المستعمرة لخلايا تقاطع الحبل والمشيمة تشبه تلك التي لوحظت للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظام مما يشير إلى أن الخلايا المشتقة من تقاطع الحبل والمشيمة تتمتع بقدرات تكاثرية وتجديد ذاتي أعلى. يشير جانب التدفق إلى التحليل المتري لمعلقات الخلية المفردة المعزولة من أنسجة الفترة المحيطة بالولادة أن النسب المئوية للخلايا الإيجابية لعلامات الخلايا الجذعية الوسيطة المحددة من جميع مصادر الأنسجة الأربعة مماثلة لتلك التي تعبر عنها الخلايا الوسيطة القياسية المشتقة من نخاع العظام. ومع ذلك ، فإن متوسط نسب شدة الفلور يشير إلى أن الخلايا المشتقة من هلام وارتون ووصلة الحبل والمشيمة متشابهة جدا أو أعلى من بطانة الحبل في الخلايا المشتقة من المشيمة الجنينية.
ومن المثير للاهتمام ، أنه على الرغم من اختلاف قيم كفاءة تشكيل المستعمرة ، فإن جميع الخلايا من مصادر الفترة المحيطة بالولادة المختلفة تعبر عن مستويات متشابهة من علامات تعدد القدرات عن طريق تحليل RTPCR الكمي باستثناء الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقة من تقاطع الحبل والمشيمة ، والتي عبرت عن أعلى مستويات التعبير لجميع علامات تعدد القدرات المختبرة. علاوة على ذلك ، تتمايز الخلايا اللحمية الوسيطة المعزولة من جميع مصادر الفترة المحيطة بالولادة بسهولة إلى أنواع الخلايا الشحمية والغضروفية والعظمية بالإضافة إلى التمايز الثلاثي المثبت. على الرغم من أن إمكانات التمايز تختلف وفقا لمصدر الخلايا اللحمية الوسيطة.
بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بكفاءة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ممارسة التقنية الجانبية وتجنب التلوث المتبادل بين مصادر الأنسجة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف طبيعة منافذ الخلايا الجذعية في أنسجة الفترة المحيطة بالولادة.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول عملية تشريح الحبل السري البشري والمشيمة الجنينية لعزل الخلايا السدوية الميزنكيمية (MSCs) باستخدام تقنية زراعة القطع النسيجية. وتتيح هذه الطريقة توصيف الخلايا السدوية الميزنكيمية من مصادر أنسجة مختلفة في فترة ما حول الولادة، مما يساهم في تطوير أبحاث بيولوجيا الخلايا الجذعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- الطب التجديدي
- تقنيات زراعة الخلايا
خلفية علمية
- تمتلك الخلايا السدوية الميزنشيمية (MSCs) إمكانات علاجية نظرًا لتعدد قدراتها التمايزية.
- تعتبر أنسجة الفترة المحيطة بالولادة مصادر غنية بالخلايا السدوية الميزنشيمية البدائية.
- يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين إنتاجية خلايا سدوية ميزنشيمية عالية الجودة من الحبل السري والمشيمة.
- إن فهم خصائص الخلايا السدوية الميزنشيمية المستمدة من مصادر نسيجية مختلفة يمكن أن يساهم في توجيه تطبيقاتها السريرية.
الغرض من الدراسة
- لعزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) من بطانة الحبل السري، وهلام وارتون (Wharton's jelly)، والوصلة بين الحبل والمشيمة، والمشيمة الجنينية.
- لتقييم جودة وخصائص الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) المشتقة من هذه الأنسجة.
- لتوفير طريقة غير جراحية للحصول على الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) لأغراض البحث والاستخدام العلاجي.
الطرق المستخدمة
- تشريح الحبل السري والمشيمة إلى مناطق تشريحية متميزة.
- استخدام التريبسين للهضم الجزئي لعينات الأنسجة.
- زراعة الأنسجة المشرحة في ظروف أوساط زراعية محددة.
- تقييم نمو الخلايا وتوصيفها باستخدام المجهر وقياس التدفق الخلوي.
النتائج الرئيسية
- لوحظت كفاءة عالية في تكوين المستعمرات في خلايا هلام وارتون ونقطة اتصال الحبل بالمشيمة.
- عبرت جميع الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) عن واسمات تعدد القدرات المماثلة، مع وجود تفاوت في مستويات التعبير.
- أظهرت الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) القدرة على التمايز إلى سلالات متعددة.
- يمكن إتمام هذه التقنية بكفاءة في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) عالية الجودة من الأنسجة المحيطة بالولادة.
- إن فهم خصائص الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) من المصادر المختلفة يمكن أن يعزز تطبيقاتها العلاجية.
- يُنصح بمزيد من الاستكشاف للمنافذ المتخصصة للخلايا الجذعية في الأنسجة المحيطة بالولادة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا السدوية الميزنكيمية (MSCs) من مصادر أنسجة مختلفة في الفترة المحيطة بالولادة، مما يوفر بديلاً غير باضع ومفضلًا أخلاقيًا للخلايا السدوية الميزنكيمية المشتقة من نخاع العظم. ومن خلال مقارنة المناطق التشريحية مثل منطقة اتصال الحبل السري بالمشيمة (CPJ)، وهلام وارتون (WJ)، وبطانة الحبل السري (CL)، والمشيمة الجنينية (FP)، تدعم هذه الطريقة التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مسارات الطب التجديدي. وتوفر كفاءة تكوين المستعمرات الأعلى والتعبير عن علامات تعدد القدرات الملحوظة في الخلايا السدوية الميزنكيمية المشتقة من منطقة اتصال الحبل السري بالمشيمة ثقة تنبؤية لتطبيقات العلاج الخلوي، مما يساعد في تحديد العناصر الرائدة وفرز المحافظ العلاجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) من منافذ محيطة بالولادة متميزة ذات قدرات متفاوتة على التكاثر والتجديد الذاتي.
- القيمة التشغيلية: يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحقق الوظيفي من تعدد القدرات عبر السلالات الدهنية والغضروفية والعظمية.
- القيمة العلمية: يعزز الثقة في الهدف من خلال تحديد هلام واتسون (CPJ) كمصدر فعال للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) مع كفاءة فائقة في تكوين المستعمرات وتعبير عن علامات تعدد القدرات.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة التشغيلية: يجهز أنظمة بيولوجية موثقة لسير العمل اللاحق من خلال إنتاج مجموعات متجانسة وملتصقة من الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) ذات سمات محددة للمؤشرات السطحية (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- القيمة العلمية: يعالج مسألة توحيد المقايسات وقابلية تكرارها من خلال تقنيات اتساق زراعة المستأصلات والمخرجات الكمية مثل كفاءة تكوين المستعمرات ومقاييس قياس التدفق الخلوي.
- القيمة التشغيلية: يسلط الضوء على الجاهزية للفحص وقابلية التوسع، حيث يتم إكمال البروتوكول في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات، مما يسمح بتقييم موثوق للمركبات في سلاسل الفحص قبل السريري.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: يناقش الصلة بالمرض وتوافق المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال إثبات القدرة على التمايز إلى ثلاثة سلالات، وهو مؤشر وظيفي رئيسي للتحقق قبل السريري.
- القيمة التشغيلية: يصف الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري عبر توفير خلايا MSCs تحافظ على مورفولوجيا ليفية ملتصقة وتعبير عن مؤشرات السطح قابلة للمقارنة مع خلايا MSCs المشتقة من نخاع العظم.
- القيمة العلمية: يركز على قيمة تقليل المخاطر التنبؤية من خلال إظهار أن خلايا CPJ-MSCs تتمايز بكفاءة أكبر من المصادر الأخرى، مما يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف بدءاً من مرحلة الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والأعمال قبل السريرية، مما يدعم اختبار الفرضيات، وتوضيح المسارات، وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) بدقة تشريحية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يوضح كيف تدعم هذه الطريقة اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين مقارنة خصائص MSC عبر بطانة الحبل السري، وهلام وارتون، ووصل الحبل بالمشيمة، والمشيمة الجنينية.
- الفحص: يصف جاهزية المقايسة، وقابلية التكرار، والمخرجات الكمية مثل كفاءة تكوين المستعمرات (59 لـ CL، و80 لـ WJ، ومشابهة لـ BM بالنسبة لـ CPJ) وتحليل تعبير العلامات القائم على قياس التدفق الخلوي.
- التحليلات: يسلط الضوء على قياسات مثل كفاءة تكوين المستعمرات، ونسب شدة الفلورة، وRT-PCR الكمي لعلامات تعدد القدرات التي تساعد الفرق على مقارنة الظروف وتقييم القيمة التنبؤية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط هذه الطريقة بالاستمرارية قبل السريرية من خلال إظهار تمايز MSC إلى سلالات دهنية، وغضروفية، وعظمية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية والتحقق الوظيفي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يصيغ هذه الطريقة كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام بدلاً من كونها تقنية أحادية الاستخدام، مما يتيح التوحيد القياسي عبر مصادر الأنسجة المحيطة بالولادة لضمان إمداد ثابت من MSC في برامج الطب التجديدي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية، والتحقق من الأهداف، والحد من الغموض الآلي من خلال عزل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) بدقة تشريحية وتوصيفها وظيفياً.
- القيمة التشغيلية: التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع عبر زراعة المستأصلات، ومعايير هضم محددة، وكثافة استزراع متسقة (1×10⁴ cells/cm²).
- القيمة الاستراتيجية: اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف، وكفاءة رأس المال، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من خلال التحديد المبكر لمصادر MSC عالية الفعالية مثل CPJ في مرحلة الاكتشاف.
- التأثير على المحفظة: ترتيب الأولويات واتخاذ قرارات التطوير بناءً على تعديل المخاطر، استناداً إلى التباين في كفاءة التكاثر، والتجديد الذاتي، والتمايز عبر مصادر MSC المحيطة بالولادة.
اعتبارات التنفيذ
- الخبرة العلمية المطلوبة في تشريح الأنسجة، وزراعة الخلايا المعقمة، وقياس التدفق الخلوي لتحليل الواسمات.
- تشمل احتياجات الأجهزة والبنية التحتية التحليلية مجهر تباين الطور، وأجهزة الطرد المركزي، والحاضنات (37°C، 5% CO₂)، وأجهزة قياس التدفق الخلوي لتقييم واسمات CD وكثافة الفلورة.
- تتضمن متطلبات التوحيد القياسي بين الفرق بروتوكولات متسقة لتشريح الأنسجة، ومعادلة التريبسين، وكثافات الاستزراع لضمان إمكانية التكرار عبر المختبرات.
- تشمل اعتبارات التكييف عبر أنظمة النماذج تعديل حجم المستنبتات ووقت الهضم بناءً على مصدر النسيج، حيث يختلف توقيت النمو الخلوي (3–4 أيام لـ CPJ، و7–10 أيام لـ CL/WJ، و11–14 يوماً لـ FP).
- تشمل القيود العملية المرتبطة بالمادة المصدرية ضرورة تجنب التلوث الخلطي بين مصادر الأنسجة أثناء التشريح، والتباين في كفاءة تكوين المستعمرات وتوقيت النمو الخلوي عبر المناطق التشريحية المختلفة.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:05
Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
