قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية
أغسطس 6, 2017
تقييم وظيفي للوصلات العصبية العضلية (NMJ) يمكن أن توفر معلومات أساسية عن الاتصال بين العضلات والأعصاب. هنا يمكننا وصف بروتوكول شامل تقييم وظائف العضلات و NMJ استخدام اثنين الاستعدادات العصبية العضلية المختلفة، أي سولاس الوركي والحجاب الحاجز فرنك.
الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة وظائف الوصلة العصبية العضلية عن طريق نهج تجريبي خارج الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحفيز تحضير العصب العضلي بطريقتين ، مباشرة على غشاء العضلات ومن خلال العصب. نظرا لأن التحفيز الغشائي يتجاوز إشارات النقل العصبي ، يمكن اعتبار أي اختلافات بين الاستجابتين الانقباضيتين قياسا غير مباشر لوظيفة التوصيل العصبي العضلي.
نقدم هنا هذا الإجراء في تحضير العصب الوركي الوحيد. يتم تشريح العضلة مع أعصابها ووضعها في حمام أنسجة مثقف. يتم تثبيته على وحدة تحكم في القوة والطول ويتم وضع زوج من الأقطاب الكهربائية البلاتينية بالتوازي مع العضلات.
ثم يتم تحريك قطب شفط زجاجي بالقرب من الطرف المقطوع للعصب. ثم يتم تطبيق بروتوكول اختبار شامل لتقييم كل من الوصلات العصبية العضلية ووظائف العضلات بدقة. العلاقة الوظيفية بين العضلات والأعصاب هي خاتمة لكل من الجزء واثنين من الفصائل الباقية.
في المنطقة الأولى من مستوى كل من الأنسجة ، تنقل هذه الوصلات العصبية العضلية ، والتي تظهر عادة ضغطا مثل التشكل. ومع ذلك ، في العديد من الحالات المرضية ، تتعرض الوظيفة المتفاعلة بين العضلات والأعصاب للخطر بشدة ويفقد الوصلة العصبية العضلية التنظيم المورفولوجي المعقد. الهدف العام من إجراءنا هو دراسة وظائف الوصلات العصبية العضلية باستخدام النهج التجريبي خارج الجسم الحي.
يتم تحقيق ذلك عن طريق تحفيز تحضير العصب العضلي بطريقتين. أحدهما عن طريق تحفيز الغشاء العضلي مباشرة والآخر عن طريق تحفيز العصب وتحليل خصائص العضلات. قم بتشغيل حمام الماء الدوراني واضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية.
املأ الحمام بمحلول Krebs-Ringer. اسمح للنقطة O أربعة بار من خليط الغاز بالتدفق عبر الأوكسيتوب وإلى الحمام. قم بتشغيل محول المشغل ومحفزات النبض.
ضبط القيم الحالية على 300 مليون زوج لتحفيز الغشاء وإلى خمسة ملايين زوج لتحفيز العصب. بعد التضحية بالفأر عن طريق خلع عنق الرحم ، قم بإزالة الجلد من الساقين. الآن قم بقطع وتر العرقوب وأثناء تثبيت الوتر بإحكام ، اسحب عضلة المعدة والنعل معا لأعلى.
بمجرد انكشاف الوتر القريب من النعل ، قم بقطع ربلة الساق بالكامل فوقه ، ثم ضع العينة بسرعة في حمام الأنسجة التحضيرية الموجود تحت المجهر الاستريو. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتثبيت الوتر القريب من النعل بإحكام واسحبه برفق لفضح التعصيب الوركي. بمجرد تعرض التعصيب ، قم بإزالة الأنسجة المحيطة للكشف عن حوالي خمسة ملليمترات من العصب.
ثم استخدم مقصا جيدا لقطع العصب بعناية. أكمل استئصال العضلات والأعصاب عن طريق قطع وتر العرقوب لفصل النعل عن المعدة. الآن العضلات ، إعداد الأعصاب جاهز ليتم تركيبه على جهاز الاختبار.
قم بإنشاء عقدة انزلاقية في نهاية خيط النايلون وشدها حول وتر العرقوب. قم بتثبيت الوتر القريب داخل المشبك الثابت واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة لمحول القوة. اسمح للعضلات بالتوازن في المحلول.
لتحديد الطول الأمثل الأولي ، قم بتحفيز العضلات بسلسلة من النبضات المفردة مع تغيير قيمة حمل الزحف برفق. يتم الحصول على الطول الأمثل عندما تكون قوة الارتعاش هي الحد الأقصى. ضع أقطاب الشفط بالقرب من العضلة واسحب العصب للداخل.
بعد ذلك ، مع تغيير قيمة تيار النبض برفق ، قم بتحفيز العضلات بسلسلة من النبضات المفردة. يجب أن تكون قوة الارتعاش الناتجة عن العضلات عند تحفيزها من خلال العصب مساوية للقيم المقاسة عند تحفيزها على الغشاء. بمجرد تحديد القيمة الحالية المثلى ، ادفع العصب خارج القطب الكهربائي وقم بتوصيل بعض النبضات الحالية.
إذا كانت كمية التيار المحدد مسبقا مفرطة ، فإن النبضات الحالية التي يتم توصيلها عبر قطب الشفط تثير تقلص العضلات عن طريق توصيل التيار عبر الحمام. باستخدام برنامج محلي الصنع ، ابتكرنا بروتوكول اختبار آلي لدراسة وظيفة الوصلة العصبية العضلية الوحيدة. يستمر البروتوكول حوالي 65 دقيقة ويتكون من أربعة أجزاء مختلفة.
في الجزء الأول ، يتم تحفيز العضلات بأربع نبضات مفردة. اثنان تم تسليمهما مباشرة واثنان من خلال العصب. ثم يتم قياس وقت الذروة ونصف وقت الاسترخاء والقيمة القصوى لمشتق القوة وقوة الارتعاش من استجابات الارتعاش.
في الجزء الثاني ، يتم تحفيز العضلات بسلسلة من قطارات النبض التي تتراوح من 20 هرتز إلى 80 هرتز ، وهو تردد الكزاز. لحساب القوة ، منحنيات التردد لكل من التحفيز العصبي والمباشر. في الجزأين الثالث والرابع من البروتوكول ، تخضع العضلات لنموذجين للإرهاق لقياس فشل الانتقال العصبي والتعب داخل الكزاز.
خلال نماذج التعب هذه ، يتم تحفيز العضلات باستمرار باستخدام قطار نبض واحد يتم توصيله على الغشاء متبوعا ب 14 قطارا نبضيا يتم توصيله عبر العصب. يتكرر التسلسل بأكمله 20 مرة. يتم تسليم النموذج الأول بتردد إطلاق 35 هرتز.
والثاني بتردد الكزاز 80 هرتز. يعتقد أن فشل النقل العصبي يلعب دورا مهما في تطور التعب لأنه يرتبط بالكتلة الخارجية لانتشار إمكانات الفعل ، وانخفاض إطلاق جهاز الإرسال وانخفاض استثارة اللوحة لقدرة إجهاد التوصيل. يتم التعبير عن جانب آخر من قدرة إجهاد الوصلات العصبية العضلية بوضوح من خلال التعب العصبي العضلي وهو تقدير لقدرة العضلات على الحفاظ على القوة أثناء تقلص الكزاز الفردي ويعكس التعب عالي التردد.
في نهاية البروتوكول ، يتم قياس صافي طول العضلات ووزنها باستخدام الفرجار التناظري ومقياس دقيق لحساب مساحة المقطع العرضي للعضلات. سلطت الدراسات التي أجريت على نموذج الفأر المعدل وراثيا SOD1 للتصلب الجانبي الضموري الضوء على إمكانات هذه المنهجية. في الواقع ، تنتج عضلات النعل المعدلة وراثيا استجابة انقباضية منخفضة لكل من مشتق القوة وقوة الكزاز عند تحفيزها مباشرة وانخفاض أكبر عند تحفيزها من خلال العصب.
فيما يتعلق بقوة الكزاز على سبيل المثال ، أظهرت هذه التجارب أن انقباض العضلات يمثل 25٪ من الضرر بينما يرتبط 45٪ أخرى بعيوب في الانتقال العصبي. نقطة أخرى مثيرة للاهتمام هي عدم وجود أي اختلاف في عضلات التحكم عند تحفيزها بشكل مباشر أو غير مباشر. تثبت هذه النتيجة أن المنهجية لا تحفز أي قطع أثرية تقنية حيث من المتوقع أن يعمل الوصلة العصبية العضلية بكامل طاقتها في الضابطة.
فيما يتعلق بالتعب العندي ، أظهرت النتائج قيما أقل بكثير في عضلات النعل المعدلة وراثيا مقارنة بنظيراتها في السيطرة. ومن المثير للاهتمام أن عضلة النعل المعدلة وراثيا تتضرر بشكل كبير بسبب التحفيز المتكرر ، مما يعني أنه يمكن تقييم وظيفة الوصلة العصبية العضلية لمدة أقصى وقت تحفيز يبلغ ثماني دقائق. بعد ثماني دقائق ، تعود العضلات المعدلة وراثيا إلى قيمة شبه صفرية من القوة عند تحفيزها.
بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن تكون قد فهمت كيفية قياس وظيفة الوصلة العصبية العضلية والعضلة الوحيدة للفأر. بالنظر إلى أن هذه التقنية تعتمد على القياس غير المباشر لوظيفة الوصلة العصبية العضلية ، فإنها لا تسمح بإجراء العيوب المبلغ عنها مرتبطة بالتغيرات المورفولوجية أو الكيميائية الحيوية. من ناحية أخرى ، يمثل هذا النهج طريقة أساسية لتقييم ما إذا كانت هذه الاعتداءات تؤثر على وظائف المستخدم لإشارة النقل العصبي.
أخيرا ، يمكن اعتماد اقتراح البروتوكول بسهولة لقياس وظيفة الوصلة العصبية العضلية للحجاب الحاجز ، وهي عضلة أخرى غالبا ما تشارك في الأمراض المرضية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتقييم وظيفة التقاطع العصبي العضلي (NMJ) من خلال المستحضرات العضلية العصبية في المختبر. يركز الدراسة على مستحضرين محددين: العَصَبُ الوَرِكي والعضلة العَقِبية والعَصَبُ الحِجابي والغشاء الحجابيّ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- فيزيولوجيا العضلات
- الفيزيولوجيا الكهربائية
الخلفية
- التقاطع العصبي العضلي حاسم للتواصل بين الأعصاب والعضلات.
- فهم وظيفة التقاطع العصبي العضلي يمكن أن يوفر رؤى حول العديد من الاضطرابات العصبية العضلية.
- المستحضرات في المختبر تسمح بظروف تجريبية متحكم بها.
- تستطيع طرق التحفيز المباشر وغير المباشر الكشف عن الاختلافات في استجابات تقلص العضلات.
غرض الدراسة
- لتقييم وظيفة التقاطع العصبي العضلي باستخدام مستحضرات العضلة والعصب.
- لمقارنة استجابات التقلص من التحفيز المباشر للعضلات مقابل التحفيز العصبي.
- لتوفير بروتوكول مفصل للباحثين الذين يدرسون ديناميات التقاطع العصبي العضلي.
الطرق المستخدمة
- تشريح العضلة والعصب للتحضير.
- وضع المستحضر في حوض أنسجة مملوء بالمحلول.
- استخدام أدوات تحكم القوة والطول لتقييم العضلة.
- تطبيق التحفيز الكهربائي عبر أقطاب البلاتين.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة اختلافات في استجابات التقلص بين التحفيز المباشر والتحفيز العصبي.
- أظهر البروتوكول بنجاح تقييم وظيفة التقاطع العصبي العضلي.
- تشير النتائج إلى أهمية طريقة التحفيز في تقييم صحة التقاطع العصبي العضلي.
- تسهم النتائج في فهم أفضل للتواصل العصبي العضلي.
الاستنتاجات
- البروتكول الموصوف فعال لدراسة وظيفة التقاطع العصبي العضلي.
- فهم ديناميات التقاطع العصبي العضلي ضروري لمعالجة الاضطرابات العصبية العضلية.
- يمكن للدراسات المستقبلية البناء على هذه المنهجية لاستكشاف جوانب أخرى من صحة التقاطع العصبي العضلي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Assessing neuromuscular junction (NMJ) functionality is critical for de-risking target validation in neurodegenerative diseases such as ALS, where impaired nerve-to-muscle signaling contributes to functional decline. This ex vivo methodology enables quantitative comparison of direct muscle versus nerve stimulation, providing a functional readout of neurotransmission efficiency that supports mechanistic insight and predictive confidence in early discovery. By isolating NMJ-specific deficits from general muscle contractility, the approach aids in prioritizing targets with stronger translational relevance to human pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying NMJ transmission failure as a functional biomarker of pathway integrity.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct comparison of stimulated contractile responses, reducing ambiguity in target mechanism.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing compounds that preserve NMJ function from those affecting only muscle contractility.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible force-frequency and twitch kinetics outputs suitable for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Measures neurotransmission failure and intratetanic fatigue as discriminative endpoints for NMJ-specific compound effects.
- Platform Scalability: Adaptable to multiple muscle-nerve preparations (e.g., soleus-sciatic, diaphragm-phrenic), enabling cross-tissue target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models NMJ dysfunction observed in ALS and aging, supporting translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed deficits stem from neuro transmission failure versus intrinsic muscle pathology, informing target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides functional data to guide go/no-go decisions based on NMJ preservation, reducing late-stage attrition due to unidentified target limitations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early hypothesis testing through functional NMJ assessment before progressing to lead identification and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring changes in neurotransmission failure and force-frequency relationships following pathway modulation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts (twitch kinetics, force-frequency curves) that enable reliable compound evaluation across plates and sessions.
- Analytics: Generates normalized metrics of neuro transmission failure and intratetanic fatigue, allowing statistical comparison between treatment and control groups.
- Translational Research: Connects to preclinical validity by modeling human-relevant NMJ decline in SOD1G93A mice, a recognized ALS model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable functional platform for NMJ assessment across multiple disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating NMJ-specific dysfunction from general muscle decline, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated software-controlled protocols and defined stimulation parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of NMJ-liable compounds, preventing investment in targets with poor functional translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting targets that preserve NMJ function, aligning with clinical expectations in neurodegenerative indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo tissue preparation, electrophysiology, and muscle force measurement techniques.
- Dependence on stabilized tissue bath perfusion, temperature control (30°C), and calibrated electrical stimulators for consistent results.
- Necessitates cross-team standardization of dissection protocols and stimulation parameters to ensure reproducibility across laboratories.
- Adaptation to different muscle-nerve pairs (e.g., diaphragm-phrenic) may require adjustments in electrode placement and stimulation thresholds.
- Limited to assessing functional NMJ integrity; does not resolve molecular or structural mechanisms underlying observed deficits.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:14
Introduction
0:40
Ex Vivo Experimental System
2:57
Dissection of Soleus Muscle and Nerve
4:04
Mounting the Soleus in the Apparatus
5:27
Testing Protocol and Data Collection
5:47
Twitch
6:09
Force Frequency Measurement
6:27
Fatigue Paradigm
7:04
Neurotransmission Functionality Specific Parameters
7:56
Results
9:40
Conclusion
