قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة وظائف الوصلة العصبية العضلية عن طريق نهج تجريبي خارج الجسم (ex vivo). ويتم تحقيق ذلك من خلال تحفيز تحضيرة العصب العضلي بطريقتين: مباشرة على غشاء العضلة ومن خلال العصب. وبما أن تحفيز الغشاء يتجاوز إشارات النقل العصبي، فإن أي اختلافات بين الاستجابتين الانقباضيتين يمكن اعتبارها قياساً غير مباشر لوظائف الوصلة العصبية العضلية.

نقدم هنا هذا الإجراء في تحضير العصب الوركي للعضلة النعلية. يتم تشريح العضلة مع العصب الخاص بها ووضعها في حمام نسيجي مُرَوّى. ثم تُثبت في جهاز تحكم في القوة والطول، وتوضع مجموعة من أقطاب البلاتين بالتوازي مع العضلة.

يتم بعد ذلك تحريك قطب شفط زجاجي ليكون قريباً من الطرف المقطوع للعصب. ثم يتم تطبيق بروتوكول اختبار شامل لتقييم كل من الوصلة العضلية العصبية ووظيفة العضلات بدقة. ويُستدل من الاتصال الوظيفي بين العضلة والعصب على حالة كلا الجزأين والجزءين المتبقيين.

في المنطقة الأولى من مستوى كل من النسيجين اللذين يتواصلان عبر هذه الوصلة العصبية العضلية، والتي تظهر عادةً مورفولوجيا تشبه الضغط. ومع ذلك، في العديد من الحالات المرضية، يتضرر التفاعل الوظيفي بين العضلات والأعصاب بشكل كبير، وتفقد الوصلة العصبية العضلية تنظيمها المورفولوجي المعقد. الهدف العام من إجراءنا هو دراسة وظيفة الوصلة العصبية العضلية باستخدام نهج تجريبي خارج الجسم (ex vivo).

يتم تحقيق ذلك من خلال تحفيز تحضيرة العصب العضلي بطريقتين؛ الأولى عن طريق تحفيز غشاء العضلة مباشرة، والثانية عن طريق تحفيز العصب وتحليل خصائص العضلة. قم بتشغيل حمام الماء الدوار واضبط درجة الحرارة على 30 °C.

املأ الحمام بمحلول Krebs-Ringer. اسمح بتدفق خليط غازي بضغط 0.4 bar عبر أنبوب الأكسجة (oxitube) وإلى داخل الحمام. قم بتشغيل محول طاقة المشغل وجهازي التحفيز النبضي.

اضبط قيم التيار على 300 مليون زوج لتحفيز الغشاء وعلى خمسة ملايين زوج لتحفيز العصب. بعد التضحية بالفأر عن طريق الخلع العنقي، قم بإزالة الجلد من الساقين. الآن اقطع وتر أخيل، وأثناء تثبيت الوتر بإحكام، اسحب العضلة التوأمية الساقية والعضلة النعلية معاً إلى الأعلى.

بمجرد كشف الوتر الداني للعضلة النعلية، يتم قطع الساق بالكامل من فوقه ووضع العينة بسرعة في حمام الأنسجة التحضيري الموجود أسفل المجهر الستيريو. وباستخدام ملقط، يتم تثبيت الوتر الداني للعضلة النعلية بإحكام وسحبه برفق للكشف عن التعصيب العجزي. وبمجرد ظهور التعصيب، تُزال الأنسجة المحيطة للكشف عن حوالي خمسة مليمترات من العصب.

بعد ذلك، استخدم مقصاً دقيقاً لقطع العصب بعناية. أكمل عملية استئصال العضلة والعصب عن طريق قطع وتر أخيل لفصل العضلة النعلية عن العضلة التوأمية الساقية. الآن أصبحت تحضيرة العضلة والعصب جاهزة للتثبيت على جهاز الاختبار.

قم بعمل عقدة انزلاقية عند طرف الخيط النايلون وأحكم ربطها حول وتر أخيل. ثم قم بتثبيت الطرف القريب من الوتر داخل المشبك الثابت، واربط سلك النايلون حول ذراع الرافعة الخاصة بمحول قياس القوة. اترك العضلة لتصل إلى حالة التوازن في المحلول.

لتحديد الطول الأمثل الأولي، قم بتحفيز العضلة بسلسلة من النبضات المنفردة مع تغيير قيمة حمل الزحف تدريجيًا. يتم الحصول على الطول الأمثل عندما تكون قوة التقلص في حدها الأقصى. ضع أقطاب الشفط بالقرب من العضلة ثم اسحب العصب إلى الداخل.

بعد ذلك، وأثناء تغيير قيمة تيار النبضات برفق، قم بتحفيز العضلة بسلسلة من النبضات المفردة. يجب أن تكون قوة الارتعاش الناتجة عن العضلة عند تحفيزها عبر العصب مساوية للقيم المقاسة عند تحفيزها على الغشاء. وبمجرد تحديد قيمة التيار المثلى، أخرج العصب من القطب الكهربائي وقم بتسليط عدد قليل من نبضات التيار.

إذا كانت كمية التيار المختارة مسبقاً مفرطة، فإن نبضات التيار الموجهة عبر قطب الشفط تؤدي إلى تحفيز انقباض العضلات عن طريق توصيل التيار عبر الحمام. وباستخدام برنامج تم تطويره داخلياً، صممنا بروتوكول اختبار مؤتمت لدراسة وظائف الوصلة العصبية العضلية للعضلة النعلية. يستغرق البروتوكول حوالي 65 دقيقة ويتكون من أربعة أجزاء مختلفة.

في الجزء الأول، يتم تحفيز العضلة بأربع نبضات فردية؛ حيث يتم تسليط نبضتين بشكل مباشر ونبضتين عن طريق العصب. بعد ذلك، يتم قياس زمن الوصول إلى الذروة، وزمن نصف الاسترخاء، والقيمة القصوى لمشتقة القوة، وقوة النفضة من استجابات النفض العضلي.

في الجزء الثاني، يتم تحفيز العضلة بسلسلة من قطارات النبضات تتراوح تردداتها من 20 hertz إلى 80 hertz، وهو تردد التكزز. وذلك لحساب منحنيات القوة والتردد لكل من التحفيز العصبي والتحفيز المباشر. وفي الجزأين الثالث والرابع من البروتوكول، تخضع العضلة لنظامين من نماذج الإجهاد لقياس فشل النقل العصبي والإجهاد داخل التكزز.

خلال نماذج الإجهاد هذه، يتم تحفيز العضلة باستمرار بواسطة سلسلة نبضات واحدة يتم توصيلها عبر الغشاء، تليها 14 سلسلة نبضات يتم توصيلها عبر العصب. يتكرر التسلسل بأكمله 20 مرة. يتم تطبيق النموذج الأول بتردد إطلاق قدره 35 hertz.

والثانية عند تردد تيتاني يبلغ 80 هرتز. ويُعتقد أن فشل النقل العصبي يلعب دوراً هاماً في تطور الإجهاد، حيث يرتبط بالحجب الخارجي لانتشار جهد الفعل، وانخفاض إطلاق الناقلات العصبية، وانخفاض استثارة الصفائح النهائية في الوصلة العصبية العضلية. وهناك جانب آخر من قدرة الإجهاد في الوصلة العصبية العضلية يتم التعبير عنه بوضوح من خلال الإجهاد داخل التيتاني، وهو تقدير لقدرة العضلة على الحفاظ على القوة خلال انقباض تيتاني واحد، ويعكس الإجهاد عالي التردد.

في نهاية البروتوكول، يتم قياس صافي طول العضلة ووزنها باستخدام فرجار تناظري وميزان دقيق لحساب مساحة المقطع العرضي للعضلة. وقد سلطت الدراسات التي أجريت على نموذج فأر SOD1 المعدل وراثياً للتصلب الجانبي الضموري الضوء على إمكانات هذه المنهجية. وفي الواقع، تظهر عضلات الساق (soleus) المعدلة وراثياً استجابة انقباضية منخفضة لكل من مشتق القوة والقوة التشنجية عند تحفيزها مباشرة، وانخفاضاً أكبر عند تحفيزها عن طريق العصب.

فيما يتعلق بالقوة التشنجية على سبيل المثال، أظهرت هذه التجارب أن قدرة العضلات على الانقباض تتسبب في 25% من الضرر، بينما ترتبط نسبة أخرى تبلغ 45% بعيوب في النقل العصبي. وهناك نقطة أخرى مثيرة للاهتمام وهي عدم وجود أي فرق في العضلات الضابطة عند تحفيزها بشكل مباشر أو غير مباشر. وتثبت هذه النتيجة أن المنهجية المتبعة لا تسبب أي تداخلات تقنية اصطناعية، حيث يُتوقع أن يكون الوصل العصبي العضلي فعالاً تماماً في الحيوانات الضابطة.

فيما يتعلق بالتعب داخل التشنج، أظهرت النتائج قيماً أقل بكثير في عضلات السمان (soleus) المعدلة وراثياً مقارنة بنظيراتها في مجموعة الضبط. ومن المثير للاهتمام أن عضلة السمان المعدلة وراثياً تتضرر بشكل كبير نتيجة التحفيز المتكرر، مما يعني أنه يمكن تقييم وظيفة الوصلة العصبية العضلية لمدة تحفيز قصوى تصل إلى ثماني دقائق. فبعد ثماني دقائق، تعود العضلة المعدلة وراثياً إلى قيمة قوة شبه منعدمة عند تحفيزها.

بعد مشاهدة الفيديو، ينبغي أن تكون قد اكتسبت فهماً لكيفية قياس وظائف الوصلة العصبية العضلية والعضلة النعلية في الفأر. ونظراً لأن هذه التقنية تعتمد على القياس غير المباشر لوظائف الوصلة العصبية العضلية، فإنها لا تسمح بتحديد ما إذا كانت العيوب المُبلغ عنها مرتبطة بتغيرات شكلية أو كيميائية حيوية. ومن ناحية أخرى، يمثل هذا النهج وسيلة أساسية لتقييم ما إذا كانت هذه الإصابات تؤثر على الوظيفة الفعلية لإشارة النقل العصبي.

أخيرًا، يمكن تبني هذا البروتوكول المقترح بسهولة لقياس وظائف الوصلات العصبية العضلية في الحجاب الحاجز، وهو عضلة أخرى غالبًا ما تتأثر بالأمراض المرضية.