الكمي للسلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة

يتمثل الهدف العام من هذه الطريقة في قياس سلوك التنظيف لدى ذبابة Drosophila من خلال تقدير ومقارنة كمية صبغة الأصفر البراقة الملونة المتبقية على أجسام الحيوانات في ظروف التنظيف وعدم التنظيف. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية والوراثة السلوكية، مثل تنسيق المهارات الحركية الدقيقة والمنظمات والدوائر الجزيئية المرتبطة بها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها سريعة وقوية وسهلة التنفيذ من قبل العديد من الباحثين والطلاب بمختلف مستويات المهارة.

سيقوم فرانكي باراديل، وهو طالب في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. لبدء التجربة، قم بتجهيز جهاز شفط لنقل ذباب الـ Drosophila الحي من قارورة المزرعة إلى غرفة التنظيف. باستخدام المقص، اقطع 1.5 feet من أنابيب Tygon.

اقطع ما لا يقل عن بوصة واحدة من طرف رأس ماصة دقيقة (micro-pipette)ها disposable سعة 1 مل، وثبّت قطعة من الشبكة بمساحة 1 سم مربع فوق فتحة الرأس المقطوع التي يبلغ قطرها 1/96 بوصة. ضع رأس ماصة دقيقة جديد سعة 1 مل بإحكام فوق الشبكة والرأس المقطوع لإنشاء غرفة احتجاز للذباب. اقطع الطرف النهائي لرأس الماصة الدقيقة الجديد لتوسيع الفتحة بما يكفي للسماح بمرور ذبابة واحدة.

سيتطابق الثقب تقريباً مع فتحة غرفة التنظيف. قم بتركيب الرؤوس المتداخلة بإحكام على طرف أنبوب Tygon. ادفع الرؤوس داخل الأنبوب لضمان التثبيت المحكم بما يسمح بتطبيق ضغط التفريغ.

على الطرف الآخر من الأنبوب، اقطع طرف رأس ماصة دقيقة سعة 200 milliliter، ثم ثبّت الطرف المقطوع الضيق داخل الأنبوب لتشكيل جانب الفوهة لجهاز الشفط. ولتحضير أنابيب حصص الغبار، زن five milligrams من صبغة صفراء زاهية على ورق وزن. صب الغبار في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 8 milliliter وأغلق الغطاء بإحكام.

بعد ذلك، ولتحضير أنابيب الإيثانول، يتم سحب 1 mL من الإيثانول بتركيز 100% باستخدام الماصة ووضعه في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 15 mL. تُوضع الملصقات التعريفية على الأنابيب، ثم تُغلق وتُحفظ لاستخدامها عند اكتمال اختبار التنظيف. يجب أيضاً تضمين عينة فارغة واحدة على الأقل تحتوي على 1 mL من الإيثانول فقط بدون ذبابة، وذلك لاستخدامها كمجموعات ضابطة سلبية.

قم بتجميع كل غرفة تهيئة عن طريق ربط اللوحة العلوية المنزلقة ذات الثقوب الأصغر، مع ترك اللوحة السفلية ذات الثقوب الأكبر مفكوكة لإضافة الغبار. ضع كل غرفة تهيئة مطلوبة بشكل مسطح على الطاولة بحيث يكون الوجه العلوي لأسفل. قم بتحميل 5 mg من حصة صبغة الأصفر الزاهي في كل غرفة، وذلك عن طريق النقر بالأنبوب على سطح الغرفة فوق البئر المطلوب.

انقر بالحجرة على الطاولة للتأكد من سقوط كل الغبار عبر الشبكة إلى الجزء العلوي من اللوحة. بعد ذلك، قم بربط اللوحة السفلية بكل حجرة، بحيث تكون النهايات الأوسع للفتحات المخروطية متجهة للخارج ولا تقع الثقوب فوق الآبار. أحكم تثبيت اللوحة السفلية جيداً، لضمان عدم انزلاقها وتسرب الصبغة.

اقلب الغرفة واطرقها بشكل مسطح على الطاولة عدة مرات بحيث يسقط الغبار عبر الشبكة ليستقر على اللوحة السفلية. حرك اللوحة العلوية للغرفة إلى الوضع المفتوح الذي تصطف فيه الثقوب الصغيرة مع الآبار الـ 15، مما يسمح بإدخال الذباب في الآبار الفردية. ضع ذبابة واحدة في شافط الفم عن طريق السحب برفق من أحد طرفي الشافط كما لو كنت تستخدم قشة.

قم بترسيب الذباب عن طريق النفخ الخفيف وتوجيه الفتحة نحو الهدف. بعد ملء البئر، قم بإزاحة اللوحة العلوية بحيث يتم حبس الذبابة في الغرفة، وضع شريطاً لاصقاً فوق فتحة البئر أثناء ملء غرفة الثقب، وذلك لمنع هروب الذبابة أثناء ملء الآبار الأخرى. وفي حال سحب عدة ذبابات في بئر واحد، اترك تلك الفتحة مكشوفة حتى تبقى ذبابة واحدة فقط.

بعد ملء جميع الآبار اللازمة بالذباب، اقلب الغرفة بحيث تكون الصفيحة السفلية إلى الأعلى، مما يسمح للمسحوق بتغطية الذباب عند سقوطه عبر الشبكة. أحكم غلق الصفيحتين العلوية والسفلية عن طريق شد البراغي، ثم ضع الغرفة على جهاز الرج (vortex) لنثر المسحوق على الذباب لمدة أربع ثوانٍ. اطرق الغرفة، بحيث تكون الصفيحة العلوية متجهة للأسفل، مقابل الطاولة مرتين، لضمان سقوط الصبغة عبر الجانب الآخر.

بعد ذلك، اقلب الغرفة بحيث يكون اللوح العلوي متجهًا للأعلى واطرق الغرفة مرتين، لضمان استقرار الصبغة في قاع الغرفة السفلية، بعيدًا عن الذبابة الموجودة في الغرفة العلوية. بالنسبة لذبابة التحكم، التي لا يُسمح لها بالتنظيف، انتقل فورًا إلى تحضير العينة. ضع الغرفة بشكل مسطح على الطاولة أو سطح العمل، مع توجيه اللوح العلوي للأعلى لمدة 30 دقيقة للسماح للذباب بالتنظيف.

ضع الحجرة في مساحة خالية من الضوضاء والاهتزازات، وذلك للحفاظ على ثبات بيئتك في جميع تجارب التنظيف. مع الحفاظ على الحجرة في وضع أفقي بحيث تكون الصفيحة العلوية للأعلى، قم بفك الصفيحة السفلية برفق وإزالتها من الحجرة، مع الحرص على عدم فقدان أي صبغة. ضع الحجرة على وسادة CO2 بتدفق هواء منخفض حتى يتم تخدير الذباب.

قم بفك اللوحة العلوية من الحجرة، وباستخدام الملقط بعناية، أمسك بإحدى الأرجل واسحب ذبابة واحدة مغبرة من كل حجرة وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter يحتوي على الإيثانول. وبمجرد أن يحتوي كل أنبوب طرد مركزي دقيق على ذبابة واحدة، أغلق الغطاء واقلب الأنابيب ثلاث مرات لرج وخلط محلول الصبغة والإيثانول. يتم تحضين الأنابيب التي تحتوي على الإيثانول والذباب لمدة خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة لضمان الإزالة الكاملة للصبغة من الذبابة إلى المحلول.

بعد مرور خمس ساعات، قم برج كل أنبوب بجهاز الـ vortex لفترة وجيزة لمدة ثانيتين لضمان إزالة الأصباغ من الذباب. انقل 50 µL من أنبوب التجربة الذي سعته 1.5 mL إلى عين في طبق معايرة ذي 96 عينًا، مع تدوين موقع كل عينة على الطبق. أضف 200 µL من الإيثانول لتخفيف العينة خمس مرات لتجنب تأثيرات التكتل الناتجة عن الذباب المكسو بكثافة بالصبغة أو عيوب التنظيف الكبيرة.

استخدم قارئ الأطباق لتحليل كل عينة عند 397 نانومتر. سجل العينة من خلال قارئ الأطباق واحفظ جدول البيانات الذي يحتوي على العينات المسجلة في الطبق. لقد استخدمنا هذه الطريقة لدراسة DopR من خلال مقارنة أداء التنظيف في طفرات DopR من النوع نقص المورف القوي (strong hypomorph) والنوع الصفري (null) مع سلالة من النوع البري.

احتفظت طفرات DopR بكمية أكبر من الصبغة بشكل ملحوظ مقارنة بنظيراتها من النوع البري أو تلك التي تم استعادتها، مما يشير إلى أن طفرات DopR كانت أقل كفاءة في سلوك التنظيف. وفي تجربة موازية على ذباب Rutabaga، أظهرت الطفرات مستويات تراكم صبغة أعلى من طفرات DopR، مما يشير إلى دور هام لـ DopR في سلوك التنظيف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع الذباب لإجراء المقايسات السلوكية وكذلك قياس سلوك التنظيف.