جنبا إلى جنب تقارب تنقية البروتين المجمعات من خلايا حقيقية النواة
January 26th, 2017
نصف هنا طريقة جديدة وقوية وفعالة لتنقية التقارب الترادفي (TAP) للتعبير عن مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة وعزلها وتوصيفها. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوصيف الكيميائي الحيوي للمجمعات المنفصلة بالإضافة إلى تحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم وظيفتها.
الهدف العام من طريقة تنقية التقارب الترادفي هذه هو عزل مجمعات البروتين المعبر عنها من الخلايا حقيقية النواة للتوصيف الكيميائي الحيوي والتجميعات الجزيئية وتحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات اللاحقة للترجمة التي تنظم وظيفتها. تتيح هذه الطريقة تنقية مجمعات البروتين السليمة من الخلايا حقيقية النواة ، لتحديد التفاعلات الجديدة والتعديلات التنظيمية بعد الترجمة التي تعمل على ضبط وظيفتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدرجة نقاء عالية وإنتاجية لمجمعات البروتين للتطبيقات النهائية في المختبر لدراسة وظيفتها ونشاطها.
يتم جمع الخلايا من تنقية تقارب STREP بعد 48 ساعة من التعدي. قم بإزالة الوسائط وأضف ثمانية ملليلتر من PBS البارد. الماصة لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا عن اللوحة.
اجمع ونقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 800 مرة جم لمدة أربع دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية PBS. قم بالدوران عند 800 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية للتخلص من أي PBS متبقي.
لبدء هذا الإجراء ، أعد تعليق كل حبيبات خلية بخمسة أضعاف حجم حبيبات الخلية لمخزن التحلل السلبي ، أو PLB. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بدوامة التعليق لفترة وجيزة ، وقم بتسخينه لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
قم بتدوير معلق الخلية عند 10 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المحللة القابلة للذوبان إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وتخلص من حبيبات الخلية. وفر 10٪ من الحجم النهائي للمحللة القابلة للذوبان كمدخلات STREP-AP وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية.
من المهم استخدام حبات STREP في الخطوة الأولى لتنقية التقارب لأن المجمعات التي تم سحبها بخرز STREP تستعيد بروتين أكثر بكثير من تلك التي يتم سحبها بخرز FLAG. باستخدام طرف ماصة واسع الفوهة ، قم بإزالة الكمية المناسبة من ملاط حبة STREP بنسبة 50٪ لتنقية التقارب. تدور عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.
قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من PLB إلى الخرز. يقلب خليط الخرز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تدور مرة أخرى.
بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرزات في PLB إلى حجم نهائي من n في 40 ميكرولتر ، حيث n هو عدد العينات. أضف 40 ميكرولترا من ملاط حبة STREP بنسبة 50٪ إلى كل عينة محللة خلية وقم بتسخينها لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. خلال إنتاج البروتين واستعادته ، يمكن استخدام لوحات متعددة من الخلايا ، ويمكن دمج عينات البروتين نفسها التي يتم تحللها من ألواح مختلفة مع جزء واحد من الخرز أثناء تنقية تقارب STREP.
بعد تحضين مخاليط ملاط حبة الخلية و STREP لمدة ساعتين ، قم بتدويرها عند 1،500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. احفظ المادة الطافية أثناء تدفق STREP AP وتخزينها عند أربع درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل STREP AP إلى الخرز.
قم بتقطيع الخرزات في خليط عازل لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل STREP AP الأول. بعد الغسيل الثالث ، انقل محلول الخرزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل لتقليل خلفية البروتين.
اغسل للمرة الرابعة باستخدام المخزن المؤقت للغسيل STREP AP. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من زبدة الغسيل اثنين. قم بموازنة الخرزات عن طريق قلب الأنابيب ثم تدور لأسفل عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية. قم بتخفيض البروتين محل الاهتمام ب 50 ميكرولتر من محلول شطف STREP. دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
قم بتدوير الخرزات عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية. يتوافق هذا الكسر مع عينة شطف STREP AP.
احتفظ بجزء الخرز عند أربع درجات مئوية لشطف ثان. Aliquot 10٪ من شطف STREP AP لتلوين الفضة و / أو النشاف الغربي. لزيادة كمية المواد الأولية لترسيب المناعة اللاحق FLAG ، يمكن تجميع عمليات إزالة STREP الأولى والثانية معا من أجل استرداد أكثر كفاءة لشطف FLAG.
ابدأ هذا الإجراء باستخدام طرف ماصة واسع الفوهة لنقل الكمية المناسبة من محلول حبة FLAG إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. تدور عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل FLAG إلى الخرز.
تدور عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام عازلة الغسيل FLAG. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخرزات في مخزن غسيل FLAG إلى حجم نهائي من n في 16 ميكرولتر ، حيث n هو عدد العينات.
أضف 16 ميكرولترا من ملاط حبة FLAG إلى شطف STREP AP المتبقي واتركه طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة الليلية لملاط حبة FLAG وشطف STREP AP ، تابع الترسيب المناعي FLAG. قم بتدوير تعليق حبة FLAG عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.
احفظ المادة الطافية أثناء تدفق FLAG IP وتخزينها عند أربع درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من مخزن غسيل FLAG إلى الخرز. قم بتسخين لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وجهاز الطرد المركزي عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل FLAG. بعد الغسيل الثالث ، انقل محلول حبة البروتين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل لتقليل الخلفية. اغسل للمرة الرابعة باستخدام المخزن المؤقت للغسيل FLAG.
قم بإزالة المادة الطافية من الدوران النهائي وأضف إلى الخرزات 30 ميكرولترا من مخزن غسيل FLAG يحتوي على 200 نانوجرام لكل ميكرولتر من ببتيد FLAG. دوامة عند 800 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد ساعتين ، قم بتدوير التعليق عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.
احصد المادة الطافية وخزنها عند أربع درجات مئوية كشطف FLAG IP. في هذا الفيديو ، تم تطبيق تنقية التقارب الترادفي ، أو طريقة TAP ، على مركب Cyclin-T1 CDK9. تم التعبير عن STREP الموسومة ب Cyclin-T1 و FLAG الموسومة CKD9 في خلايا HEK293 T.
كما تم إجراء تجربة متبادلة باستخدام STREP الموسومة CDK9 و FLAG الموسومة Cyclin-T1. يظهر تحليل اللطخة الغربية أن FLAG الموسومة CKD9 مع STREP الموسومة Cyclin-T1 من خرز STREP ، ولكن ليس في التحكم السلبي ، AP تفتقر إلى STREP الموسومة Cyclin-T1. تم اكتشاف كلا البروتينين في شطف FLAG ، مما أكد التكوين المعقد.
تظهر نتائج TAP المتبادلة أن FLAG الموسومة Cyclin-T1 مع STREP الموسومة CDK9 ، مما يؤكد بشكل أكبر أن تفاعل Cyclin-T1 CDK9 مستقل عن الحلقات المستخدمة. كما تم تحليل نتائج TAP و TAP المتبادل عن طريق تلطيخ الفضة. تشير العلامات النجمية إلى الشوائب الملطخة.
FLAG الموسومة ب CKD9 مع STREP الموسومة ب Cyclin-T1 من حبات STREP ، ولكن ليس من عنصر التحكم AP.In شطف FLAG اللاحق ، STREP الموسومة ب Cyclin-T1 مع FLAG الموسومة CDK9 من حبات FLAG. وبالمثل، قام FLAG بوضع علامة على Cyclin-T1 مع وضع علامة على STREP CDK9 من حبات STREP، ولكن ليس من نقطة الوصول للتحكم. وتم استعادة مركب البروتين والبروتين بكفاءة بعد خطوة FLAG IP الثانية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين ، بدءا من عندما تكون الخلايا جاهزة للجمع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زيادة عدد ألواح الخلايا لكل تجربة وفقا لذلك لضمان إمكانية استعادة ما يكفي من البروتين واكتشافه. على سبيل المثال ، تحديد الوحدات الفرعية التنظيمية الجديدة و / أو دراسة التعديلات اللاحقة للترجمة على الوحدات الفرعية المعقدة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين الذين يدرسون تفاعلات البروتين والبروتين لاستكشاف تفاعلات جديدة وتعديلات ما بعد الترجمة في الخلايا حقيقية النواة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البروتينات وتوصيفها باستخدام علامات STREP و FLAG.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتنقية التقارب المتسلسل (TAP) مصممة لعزلة وتوصيف معقدات البروتين بكفاءة من الخلايا حقيقية النواة. تمكن الطريقة من تحديد المتفاعلين الجدد والتعديلات بعد الترجمة التي تؤثر على وظيفة البروتين.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
- تفاعلات البروتين
الخلفية
- تنقية التقارب المتسلسل هي تقنية تستخدم لعزلة معقدات البروتين.
- فهم تفاعلات البروتين أمر بالغ الأهمية لتوضيح الوظائف الخلوية.
- التعديلات بعد الترجمة تلعب دورًا مهمًا في تنظيم نشاط البروتين.
- تعزز هذه الطريقة من نقاء وعائد معقدات البروتين للتحليل الإضافي.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة TAP قوية لعزل معقدات البروتين.
- تسهيل التوصيف الكيميائي الحيوي للمعقدات البروتينية.
- تحديد المتفاعلين الجدد والتعديلات التنظيمية.
الطرق المستخدمة
- عزلة معقدات البروتين من الخلايا حقيقية النواة.
- استخدام تنقية التقارب بـ STREP بعد 48 ساعة من التحول.
- استخدام PBS البارد لفصل الخلايا.
- التطبيقات اللاحقة في المختبر لدراسة وظيفة البروتين.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق نقاء وعائد عالٍ للمعقدات البروتينية المعزولة.
- تسهيل تحديد المتفاعلين الجدد.
- تم توصيف التعديلات بعد الترجمة التي تنظم وظيفة البروتين.
- ثبت أن الطريقة فعالة للتوصيف الكيميائي الحيوي.
الاستنتاجات
- طريقة TAP هي أداة قيّمة لدراسة معقدات البروتين.
- تسمح بتحديد التفاعلات التنظيمية الرئيسية.
- يمكن لهذا النهج تعزيز فهمنا لوظيفة البروتين ونشاطه.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Tandem affinity purification (TAP) using STREP- and FLAG-tagged proteins enables high-purity isolation of eukaryotic protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method facilitates identification of novel interactors and post-translational modifications, improving predictive confidence in protein function and complex assembly. This approach reduces biological ambiguity in target selection and supports scalable workflows for lead identification and preclinical characterization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating intact protein complexes from eukaryotic cells for functional characterization.
- Operational Value: Supports biological de-risking through high-yield purification of complexes containing transiently expressed regulatory subunits.
- Predictive Value: Enhances target confidence by enabling detection of co-purifying interactors and regulatory modifications via mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated eukaryotic protein complexes for downstream biochemical assays measuring enzymatic activity or binding kinetics.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible isolation of complexes with defined subunit composition and modification status.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets by combining lysates from different cell plates during STREP bead incubation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes disease-relevant protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic components, enabling mechanistic insight into host-pathogen interactions.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation by generating complexes suitable for structural and functional studies.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying novel regulatory subunits and post-translational modifications that fine-tune complex function.
Pipeline & Workflow Integration
The TAP method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biochemical characterization of protein complexes prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating complexes to identify novel interactors and regulatory post-translational modifications.
- Screening: Enables assay readiness by producing purified complexes suitable for in vitro activity and binding assays.
- Analytics: Generates quantitative outputs via mass spectrometry and Western blot analysis to compare complex composition under different conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by characterizing complexes from eukaryotic or pathogenic systems for mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple targets, as the same STREP and FLAG bead workflow can be applied across different epitope-tagged constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and identification of novel regulatory mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of protein complex isolation across multiple experimental conditions.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved target validation, capital efficiency in early discovery, and reduced late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated complex composition and modification status.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, eukaryotic cell culture, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation equipment, microcentrifuge tubes, and STREP and FLAG affinity resins.
- Necessitates cross-team standardization of tag placement, lysis buffer composition, and wash stringency for reproducible results.
- Requires adaptation considerations when applying to different eukaryotic cell lines or pathogenic protein expression systems.
- Practical limitation: Efficiency depends on transfection efficiency and expression levels of epitope-tagged constructs in eukaryotic cells.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
