Name: توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: استكشف تقنية تتبع الخرز في دراسة المحركات السوطية البكتيرية باستخدام E. coli. تتيح هذه الطريقة تسجيل الاستجابات في الوقت الفعلي لفهم السلوك الميكانيكي الحيوي للمحركات الجزيئية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يقر المؤلفون بهوارد بيرج لهدية مجهر تتبع الخرز / المضاعفات الضوئية ومحطة تكساس إيه آند إم للتجارب الهندسية للحصول على الأموال.

1. خلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة المطلوب تحمل فليك زجة أليل 15،22 في تريبتون مرق (السل، 1٪ ببتون، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم)، يليه التلقيح في 1: 100 التخفيف في 10 مل السل جديدة. تنمو ثقافة في 33 درجة مئوية في حاضنة شاكر حتى OD 600 = 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق بيليه بقوة في 10 مل من فلتر تعقيم العازلة الحركة (MB و 10 ملي الفوسفات عازلة: 0،05-0،06 M كلوريد الصوديوم، و 10 -4 M EDTA، 1 ميكرومتر ميثيونين، 7.0 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.2 مرتين أخريين وإعادة تفريق بيليه النهائي في 1 MB مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القص والتعليق من المارة ذهابا وإيابا ~ 75 مرات بين اثنين من المحاقن مع 21 إلى 23 محولات قياس متصلة بواسطة البولي ايثيلين أنابيب (7-12 سم، وقطره 0.58 ملم الداخلي). الحد من الوقت الكلي لتقطيع إلى 30 - 45 ق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا المنفصمة في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق وإعادة تفريق للبيليه في 100-500 ميكرولتر من MB. </li></ol> 2. الانزلاق التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة التصوير التي يقحم اثنين من أشرطة لاصقة على الوجهين بين غطاء الانزلاق وشريحة المجهر. لفحوصات الكيميائي، وتوظيف أي غرفة الموائع الدقيقة التي تمكن من تبادل MB والمنشطات الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.01٪ بولي-L-يسين الحل في الغرفة وبعد 5 دقائق شطف بلطف الأسطح MB (80-100 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من تعليق خلية في الغرفة وإتاحة الوقت الكافي للمرفق إلى سطح الزجاج (7-8 دقيقة). تتدفق الخلايا فاشل بإضافة 100 ميكرولتر MB على جانب واحد من الغرفة، في حين فتل الحل مع ورقة مرشح من الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-15 ميكرولتر من الخرز اللاتكس في غرفة والسماح حبات الوقت الكافي لتسوية ونعلق على الخلايا (7-8 دقيقة). شطف بلطف مع 100 ميكرولتر من MB، كما هو موضح في الخطوة 2.3، لإزالة فاشل الخرز. استخدام مجموعة من حبة الاشتراكيةZES للتجارب طويلة حتى يتوفر النقيض جيدة. </li></ol> 3. تتبع الخرزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العينة على مرحلة المجهر ومسح سطح حبات تعلق على المحركات. استخدام هدفا 40X مرحلة لإبداء الملاحظات على الرغم من أن المرحلة المجهري ليست ضرورية. بدلا من ذلك، تستخدم التصوير مشرق الميدان طالما يتم الحفاظ على النقيض كافية للتمييز بوضوح حبة مشرق على خلفية داكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم اختيار حبة، نقل مرحلة أفقيا لوضع حبة في زاوية محددة مسبقا كما هو مبين في الشكل 1B. حبات موقف في نفس الزاوية لضمان أن اتجاه دوران حبة يعرف بشكل صحيح. حبة مسار المثالي هو دائري تقريبا ولكن مسارات بيضاوية هي مقبولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على وتيرة أخذ العينات أعلى من ضعف وتيرة دوران المحرك لتجنب الأخطاء المرتبطة التعرج. في هذا العمل، واستخدام السيارات التي كانت الدورية في50 هرتز وعينة على ترددات التي كانت أعلى 10 مرات (500 هرتز)، للحصول على إشارة على نحو سلس. </li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مركز ومقياس الفولتية الناتج PMT والإهليليجية الصحيح في مسارات مع التحولات أفيني إذا لزم الأمر 23. استخدام تحليل قوة الطيف لتحديد معدلات دوران 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الزوايا القطبية، θ (ر) = ATAN (ذ (ر) / س (ر)). تحديد الاختلافات في سرعات المحرك وتبديل مع مرور الوقت عن طريق حساب ω <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توظيف مرشح متوسطي لضمان سلاسة البيانات سرعة المحرك. ينصح نافذة تصفية أكثر من التناوب الكاملة 23،24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

من أجل تسهيل المربوطة حبة تتبع وتقدير الصحيح من المحركات عزم الدوران، يجب مراجعة المعلومات التالية. عند إجراء هذه القياسات مع خلايا سوطي، والقص هو خطوة حاسمة. قص يقلل من خيوط سوطي إلى مجرد كعب، وبالتالي ضمان أن يكون الحمل لزج على المحرك يرجع في الغالب إلى حبة ويمكن تقديره في الخطأ 10٪ 16. كما يحسن قص فرص العثور على مسارات دائرية مع غرابة الاطوار موزعة بإحكام (&lt;حبة قطرها 14). النتائج القص غير لائقة في مسارات الضال، مما يضاعف الأخطاء في تتبع وفي حساب المؤثرا...

المحركات سوطي تمكن خلايا السباحة عن طريق تناوب خيوط الخلية حلزونية. كمية من عزم الدوران المحرك يمكن أن تولد لمدة معينة من السوط (أي الحمل لزج) يحدد سرعة السباحة. من ناحية أخرى، قدرته على تبديل اتجاه دوران تسيطر هجرة الخلايا في الاستجابة للمواد الكيميائية، وهي عملية تعرف باسم الكيميائي. الكيميائي والحركة كونها عوامل الفوعة 1-3، والمحركات سوطي تم التعرف بشكل جيد على مدى 4 سنوات. وتشير أدلة متزايدة الآن أن المحرك بمثابة mechanosensor - يكشف ميكانيكيا وجود ركائز متينة 5،6. هذه القدرة على الأرجح يساعد في إحداث الاستعمار السطحية والالتهابات 5،7. ونتيجة لذلك، فإن الآليات التي تستشعر المحرك الأسطح ويبادر إشارات ذات مغزى 8،9. المحرك سوطي يمكن دراستها بسهولة عن طريق الربط في flagellأم إلى الركيزة ومراقبة دوران الخلية. وقد تحقق هذا الربط لأول مرة من قبل سيلفرمان وسيمون، الذي عمل مع متحولة polyhook في كولاي والسنانير تعلق بنجاح إلى ركائز الزجاج مع أضداد هوك 10. تمكين فحص خلايا المربوطة الباحثين لدراسة ردود المحرك التحول إلى مجموعة متنوعة من المحفزات الكيميائية. على سبيل المثال، سيغال وزملاء العمل حفز كيميائيا الخلايا المربوطة مع المعونة من الماصات iontophoretic. التغييرات المقابلة في التحيز CW (جزء من المحركات الوقت تدور في اتجاه عقارب الساعة، CW) مكنهم من قياس حركية التكيف في شبكة الكيميائي 11،12. في حين كان فحص الخلايا المربوطة فعال في دراسة ردود التبديل، وكان قادرا على تقديم نظرة ثاقبة ميكانيكا السيارات على نطاق محدود من الأحمال لزجة 13 فقط. للتغلب على هذه المشكلة، المربوطة ريو وزملاء العمل كروية، والخرز اللاتكس لخيوط بذرة على خلايا تمسك السطوح. وكانت حباتثم تتبعها باستخدام التداخل العودة التنسيق مع ضعف الفخاخ البصرية 14. من خلال العمل مع حبات من مختلف الأحجام، يمكن للباحثين دراسة المحرك على نطاق أوسع بكثير من الأحمال. تم تحسين هذا الاختبار في وقت لاحق من قبل يوان وبيرغ، الذي طور تقنية حبة تتبع القائم على مضخم جنبا إلى جنب مع إضاءة الليزر الظلام الميدان. طريقتهم تتبع تمكين من nanobeads المربوطة الذهب التي كانت صغيرة جدا (~ 60 نانومتر) أن المقاومة لزجة الخارجية كانت أقل مقارنة مع المقاومة لزجة الداخلية للتناوب 15،16. وأدى ذلك إلى قياسات أقصى سرعة للتحقيق في كولاي (~ 300 هرتز). في الخامس alginolyticus، المقايسات حبة مماثلة مكنت قياسات لمعدلات الغزل في الأحمال المتوسطة لزجة (~ 700 هرتز) 17. من خلال تمكين قياس الاستجابات الحركية على مجموعة كاملة ممكن من الأحمال لزجة (من صفر-تحميل لشبه كشك)، قدمت المقايسات حبة أداة الفيزيائية الحيوية الهامة لفهم رعملية توليد orque-18،19. في الآونة الأخيرة، فإننا تعديل فحص يوان بيرغ لتشمل ملاقط البصرية التي مكنتنا من تطبيق مؤثرات الميكانيكية الدقيقة لمحركات الفردية 6. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن مولدات القوة التي تدوير المحرك هي mechanosensors ديناميكية - أنها إعادة تشكيلها في استجابة للتغيرات في الأحمال لزجة. فمن الممكن أن هذا استشعار الحمل يؤدي إلى تمايز الخلايا البكتيريا يحتشدون، على الرغم من أن الآليات لا تزال غير واضحة. ومن المرجح أيضا أن المحركات سوطي في الأنواع الأخرى هي أيضا mechanosensitive 20، على الرغم من الأدلة المباشرة غير موجودة. هنا، نحن نناقش النهج القائم على مضخم (PMT) لتتبع دوران من الخرز اللاتكس المربوطة إلى خيوط سوطي 15. بالمقارنة مع تتبع مع الكاميرات فائق السرعة، ومضخم-الإعداد هو مفيد لأنه واضح ومباشر نسبيا لتعقب الخرز واحد في الوقت الحقيقي، وأكثر من الجافية طويلةستعقد. وهي مفيدة بشكل خاص عند دراسة طويلة وقت إعادة عرض في المجمعات المحرك سوطي بسبب المحفزات البيئية 21. على الرغم من أننا بروتوكولات التفاصيل خصيصا لكولاي، ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة المحركات سوطي في الأنواع الأخرى.

<table><tbody><tr><td>محلول بولي إل ليسين (0.1٪)</td> <td>سيجما ألدريتش</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences، Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 مل لورير زلة تلميح حقنة</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>كلاي آدامز محول لور-كعب 23 مقياسا</td><td>بيكتون وديكنسون وشركاه</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب البولي إيثيلين</td> http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp <td>هارفارد 59-8325</td><td></td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>المضاعف الضوئي أنابيب</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>نطاق الاستجابة الطيفية من 300 إلى 920 نانومتر ، ذروة الطول الموجي 630 نانومتر ، &nbsp ؛ 0.78 نانوثانية وقت الاستجابة &nbsp ؛ http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>شقوق دقيقة 3 × 1 مم</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 شق مثبتة بزوايا قائمة على بعضها البعض على أنابيب المضاعف الضوئي راسم</td></tr><tr><td>الذبذبات</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>العلامات التجارية البديلة مقبولة. راسم الذبذبات الرقمي ، سلسلة TBS 1000B ، 2 تناظري ، 30 ميجاهرتز ، 500 MSPS ، 2.5 kpts &nbsp ؛ http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 Pole LP / HP Filter</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>العلامات التجارية البديلة مقبولة. يوصى بنطاق تردد من 0.1 هرتز إلى 200 كيلو هرتز. &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot المجهر</td><td>نيكون</td><td>NA</td><td>يمكن استخدام أي مجهر طور مستقيم أو مقلوب. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R: T) مكعب Beamsplitter</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

دور المحركات السوطية في الحركة البكتيرية والانجذاب الكيميائي مفهوم جيدا. تشير الاكتشافات الحديثة إلى أن محركات السوط قادرة على إعادة تشكيلها استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات البيئية وهي من بين مسببات الاستعمار السطحي والعدوى. من المحتمل أن تعتمد الآليات الدقيقة التي تعيد بها المحركات تشكيل وتعزيز التكيف الخلوي على السمات الحركية الرئيسية. تتيح تقنية تتبع الخرزة القائمة على المضاعف الضوئي المعروضة هنا التوصيف الفيزيائي الحيوي الدقيق للوظائف الحركية ، بما في ذلك التكيفات في سرعات المحرك وديناميكيات التبديل. يوفر هذا النهج ميزة التتبع في الوقت الفعلي والقدرة على استكشاف السلوك الحركي على مدى فترات طويلة. يمكن توسيع البروتوكولات التي تمت مناقشتها بسهولة لدراسة المحركات السوطية في مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية.

يظهر الإعداد مضخم في الشكل 1A. ومن المهم أن هذه الفرق لديها حساسيات عالية على مجموعة من موجات متفرقة عن طريق حبات من الفائدة. هذه الفرق يعملون هنا تعمل في نطاقات المرئية والأشعة تحت الحمراء القريبة، وكانت قادرة على كشف الضوء المتناثرة التي كتبها حبات تنيره مصدر ضوء الهالوجين. فإن ظروف الإضاءة المثلى والفولتية العرض تختلف من الإعداد واحد إلى آخر. لإعداد المستخدمة في هذا العمل، وهذا مكسب PMT ~ 10 أبريل - 10 مايو...

تشير النتائج الحديثة إلى أن المحركات البكتيرية السوطي تستشعر مجموعة متنوعة من الإشارات البيئية وتعيد تشكيلها استجابة لذلك. من المتوقع أن تساعد فحوصات الخرز التي تمت مناقشتها هنا في تفسير دور إعادة التشكيل في التكيف الخلوي مع الضغوطات البيئية.

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو قياس دوران حبيبات المسبار المرتبطة بمحركات سوطية فردية في خلايا بكتيرية حية. وتوفر التقنية التي سنصفها ميزة التتبع في الوقت الفعلي لاستجابات المحرك والقدرة على التمييز بين البيانات المقبولة وغير المقبولة في الوقت الفعلي. ويساعدنا هذا النهج في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا الميكانيكية والكشف عن الفيزياء الكامنة وراء سلوك المحركات الجزيئية.على الرغم من أننا نستخدم هذه التقنيات بشكل أساسي لدراسة المحركات السوطية في بكتيريا E.coli، إلا أنه يمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لدراسة المحركات في أنواع أخرى من البكتيريا السوطية. قم بتنمية مزارع ليلة كاملة من السلالة المطلوبة التي تحمل أليل fliC اللزج في وسط TB. وفي اليوم التالي، قم بتلقيح 10 milliliters من وسط TB الطازج بتخفيف 1:100. قم بتنمية المزرعة عند درجة حرارة 33 degrees Celsius في حاضنة هزازة حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.5.قم بترسيب الخلايا عند 1500 ×g لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق. بعد ذلك، أعد توزيع الراسب بقوة في 10 milliliters من محلول منظم للحركة معقم بالترشيح. كرر عمليتي الطرد المركزي وإعادة التعليق مرتين إضافيتين.أعد توزيع الراسب النهائي في 1 ملليلتر من MB. قم بقص المعلق عن طريق تمريره ذهاباً وإياباً حوالي 75 مرة بين محقنتين مزودتين بمهايئات عيار 21 إلى 23 متصلتين بأنبوب بولي إيثيلين. اجعل الوقت الإجمالي لعملية القص ما بين 30 إلى 45 ثانية. بعد طرد الخلايا المقصوصة مركزياً، أعد توزيع الراسب في 100 إلى 500 ميكرولتر من MB. قم بتجهيز غرفة التصوير عن طريق وضع شريطين لاصقين مزدوجي الوجه بين شريحة غطاء وشريحة مجهرية.أضف محلول poly-L-lysine بتركيز 0.01% في الغرفة، وبعد خمس دقائق، اشطف الأسطح برفق باستخدام MB. أضف 40 microliters من معلق الخلايا إلى الغرفة واترك وقتًا كافيًا للالتصاق بالسطح الزجاجي. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة عن طريق إضافة 100 microliters من MB على أحد جانبي الغرفة، مع سحب المحلول باستخدام ورق ترشيح من الجانب الآخر. بعد ذلك، أضف من 10 إلى 15 microliters من حبيبات اللاتكس إلى الغرفة.استخدم مجموعة من أحجام الخرز في التجارب التي تؤدي إلى تباين جيد. اترك الخرز لفترة كافية ليركد ويلتصق بالخلايا. اشطف الخرز برفق باستخدام 100 µL من MB لإزالة الخرز غير الملتصق.ضع العينة على منصة المجهر وافحص السطح بحثاً عن الخرزات المتصلة بالمحركات. استخدم التصوير بالمجال المضيء مع عدسة شيئية بقوة 60X طالما تم الحفاظ على تباين كافٍ لتمييز الخرزة المضيئة بوضوح على خلفية داكنة. بمجرد اختيار خرزة، حرك المنصة جانبياً لوضع الخرزة في زاوية محددة مسبقاً.ضع الخرزات في الزاوية نفسها لضمان معرفة اتجاه دوران الخرزة بشكل صحيح. حافظ على تردد أخذ العينات بحيث يكون أعلى من ضعف التردد الدوراني للمحرك لتجنب الأخطاء المرتبطة بالتداخل (aliasing). في هذا العمل، استُخدمت ترددات أخذ عينات كانت أعلى بـ 10 مرات لمراقبة محرك يدور بتردد 50 hertz.إذا بدت الخرزات، بعد عملية الربط، وكأنها تتذبذب بلامركزية تزيد عن مرة إلى مرتين من نصف قطر الخرزة، فيوصى بإجراء عملية قص الخلايا لعدد أكبر من المرات. يظهر هنا مقارنة بصرية بين خرزة مربوطة بشكل صحيح وخرزة غير مربوطة. وتتمثل مخرجات مضاعفي الضوء، التي تم أخذ عيناتها بتردد 500 hertz، على مدى فترة زمنية قصيرة من القياس.استُخدمت المخرجات المُرشحة من أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs)، بعد إجراء عمليتي التمركز والقياس، لإعادة بناء المسارات الدائرية للخرزة الدوارة، كما هو موضح هنا. يكون مسار الخرزة المثالي دائرياً تقريباً، ولكن يُسمح بالمسارات الإهليلجية. تُمثل السرعات الزاوية المحسوبة من مسارات الخرزة لمحرك واحد على مدار نافذة زمنية مدتها ثلاث ثوانٍ.يُشار إلى الانتقالات المتكررة للمحرك بين اتجاهي الدوران عكس عقارب الساعة ومع عقارب الساعة من خلال التبديل بين القيم الموجبة والسالبة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تتبع الخرزات المرتبطة بمحركات سوطية مفردة بدقة عالية، باستخدام التقنيات القائمة على مضاعف الضوء المعروضة هنا. يفرض المحرك السوطي البكتيري مجموعة فريدة من التحديات نظراً لقدرته على الدوران بسرعات تصل إلى عدة مئات من الهرتز.سهّل التتبع عالي الدقة لخرزات المسبار المربوطة بالمحركات الجزيئية توصيف أنواع عدة من المحركات، بما في ذلك الكاينيسينات والميوسينات وF1-ATPase. وقد مكّن توسيع نطاق تقنية ربط الخرزات لتشمل المحركات السوطية الباحثين من دراسة ميكانيكا المحركات بدقة غير مسبوقة. وسوف يساعد العرض المرئي لهذه الطريقة الباحثين الراغبين في استخدام هذه التقنية على تجاوز التحديات، مثل تحديد مواقع الخرزات المربوطة بشكل مناسب بمحركات فردية.ومن المتوقع أن تمكّن الطرق الموضحة هنا من تطوير رؤى جديدة حول مدى قدرة هذه الآلات النانوية على التكيف في مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يتم النقل داخل الخلايا للشحنات ، مثل الحويصلات أو العضيات ، بواسطة البروتينات الحركية الجزيئية التي تتعقب الأنابيب الدقيقة المستقطبة. يصف هذا البروتوكول ارتباط اتجاه نقل جزيئات البضائع الفردية التي تتحرك داخل الخلايا العصبية ، بالكمية النسبية ونوع البروتينات الحركية المرتبطة بها.

تميز التركيب الجزيئي للسيارات على محور عصبي نقل البضائع عن طريق &quot;شحن رسم الخرائط&quot; تحليل

والهدف من هذا البروتوكول هو تشكيل الفرق من المحركات الجزيئية علي الحمض النووي النانو اوريغامي ومراقبه الحركة الفرقة باستخدام المجهر الداخلي انعكاس الكلي.

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.

التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر

يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.

تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك

هنا ، نصف بناء طفرات فارغة من Aeromonas في جليكوزيل ترانسفيراز محددة أو مناطق تحتوي على جليكوزيل ترانسفيراز ، ومقايسات الحركة ، وتنقية السوط التي أجريت لتحديد مشاركة ووظيفة إنزيماتها المشفرة في التخليق الحيوي للجليكان ، وكذلك دور هذا الجلايكان في التسبب البكتيري.

توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

يتم عرض ومناقشة تشكيل حزم أكتوميوزين في المختبر وقياس توليد قوة مجموعة الميوسين باستخدام ملاقط بصرية.

فحص ميكانيكا فرقة الميوسين في حزم خيوط الأكتين باستخدام ملاقط بصرية

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعادة تشكيل حزم الأنابيب الدقيقة في المختبر وتحديد القوى التي تمارس داخلها مباشرة باستخدام الاصطياد البصري المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. يسمح هذا الفحص بقياس القوى والإزاحات الناتجة عن مجموعات البروتين داخل شبكات الأنابيب الدقيقة النشطة على مستوى النانو.

قياس القوى مباشرة داخل حزم الأنابيب الدقيقة النشطة المعاد تشكيلها

توضح هذه الدراسة تنقية KIF1A (1-393LZ) ، وهو عضو في عائلة kinesin-3 ، باستخدام نظام التعبير عن الفيروس البقعي Sf9. أظهر تحليل الانزلاق أحادي الجزيء ومتعدد المحركات في المختبر لهذه المحركات المنقاة خصائص حركية قوية مماثلة للمحركات من محللة خلايا الثدييات. وبالتالي ، فإن نظام Sf9-baculovirus قابل للتعبير عن البروتين الحركي ذي الأهمية وتنقيته.

تحليل جزيء واحد لمحركات عائلة Kinesin-3 فائقة المعالجة المنقى Sf9

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إجراءات إنتاج الإنزيم الهولوجيني البشري myosin-7a بشكل مؤتلف باستخدام نظام MultiBac Baculovirus ولدراسة حركته باستخدام مقايسة انزلاقية مخصصة في المختبر.

التنقية القائمة على نظام MultiBac والتوصيف الفيزيائي الحيوي للميوسين البشري -7a

استكشف تقنية تتبع الخرز في دراسة المحركات السوطية البكتيرية باستخدام E. coli. تتيح هذه الطريقة تسجيل الاستجابات في الوقت الفعلي لفهم السلوك الميكانيكي الحيوي للمحركات الجزيئية.

توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات

استكشف المزيد من الفيديوهات