إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

الهدف العام من هذا الإجراء هو توسيع الخلايا الظهارية للمريء المشتقة من المريض من الخزعات بالمنظار لدراسة أمراض المريء ، أو لإنشاء سقالة مريء ثلاثية الأبعاد لنمذجة المصب أو استبدال أنسجة المريء. يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم دور الخلايا الظهارية للمريء بشكل أفضل في مرض المريء. يمكن استخدامها أيضا لرؤية السقالات ثلاثية الأبعاد للنمذجة أو الزرع.

هذه التقنية هي أنها تسمح لنا بتوليد خلايا ظهارية محددة للمريض من قطعة صغيرة جدا من الأنسجة دون الحاجة إلى أي تعديلات جينية أو دائمة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم التسبب في التهاب المريء اليوزيني ، بالإضافة إلى تطوير علاجات لرتق المريء والتهاب المريء اليوزيني. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية من أجل القدرة على إزالة الخلايا المغذية تماما قبل حصاد الخلايا الظهارية للمريء البشرية من أجل الحفاظ على النقاء.

سيظهر هذه التقنية كريستوفر فوستر ، فني من مختبرنا. قبل ثلاثة أيام على الأقل من الحصول على عينات المريض ، قم بوضع خلايا 3T3 في وسط زراعة 3T3 في قوارير T75 المعالجة بالأنسجة. في يوم التجربة ، قبل الحصول على العينات مباشرة ، افصل خلايا 3T3 مع 5 ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA لكل قارورة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

عندما تطفو معظم الخلايا ، أضف 5 ملليلتر من وسط 3T3 لإيقاف التفاعل ، وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في وسط للعد. بعد ذلك ، انقل العدد المناسب من الخلايا للبذر إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

بعد ذلك ، أضف 25 مل من وسط 3T3 الطازج إلى الخلايا للإشعاع عند 3000 راد. بعد ذلك ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط البرمجة الشرطي عند خمسة ملليلتر لكل 100 لوح ملم. بعد الحصول على ما يقرب من ست خزعات من المريء في وقت التنظير الداخلي ، ضع ست خزعات في أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مليلتر يحتوي على وسط الخلايا الكيراتينية الكامل الخالي من المصل ، مع استكمال Primocin على الجليد الرطب.

ضع خزعة واحدة في خمسة ملليلتر من الفورمالين المخزن على الثلج الرطب ، وضع خزعة واحدة في خزعة صغيرة تحتوي على وسط تضمين. اغمر القالب على الفور في كوب من الثلج أو البنتان داخل وعاء من النيتروجين السائل. بمجرد تجميد الأنسجة ، ضع التبريد في كيس عينة على ثلج جاف ، في وعاء رغوة البوليسترين.

بعد ذلك ، ضع أنابيب الخزعات داخل كيس قابل للغلق داخل صندوق شحن مع ملصق الخطر البيولوجي الذي يحتوي على ثلج مبلل ، وأغلق كلتا الحاويتين ومسميتهما بملصق بيولوجي لنقلهما إلى المختبر. عند دخول المختبر ، انقل الخزعة المجمدة على الفور إلى تخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر لتقطيع المصب أو استخراج الحمض النووي الريبي. ضع العينة في الفورمالين في ثلاجة أربع درجات مئوية للتثبيت طوال الليل وضع الخزعات المتبقية في جهاز الطرد المركزي.

استبدل الوسط الموجود في كل أنبوب ب 10 مل من محلول متباين ، وأغلق الأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. في نهاية الحضانة ، قم بتدوير الخزعات مرة أخرى ، وأعد تعليق العينات في خمسة ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA. انقل الخزعات إلى صفيحة معقمة واحدة سعة 100 ملليلتر ، واستخدم شفرات حلاقة معقمة لفرم الأنسجة بأكبر قدر ممكن من النعومة.

عندما يتم قطع كل الأنسجة ، انقل شظايا الأنسجة إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر ، واشطف اللوحة مرتين بخمسة ملليلتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA. قم بتجميع الغسالات في الأنبوب ، وأعد العينات إلى حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي لقطع العينة المهضومة والخلايا المغذية ، وأعد تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من وسط إعادة البرمجة الشرطي ، كل منها.

بعد ذلك ، اجمع بين عينات خزعة المغذية والمريء في أنبوب واحد ، وأضف rho kinase ، أو مثبط ROCK ، إلى الخلايا لزراعتها المشتركة في طبق زراعة الأنسجة المطلي بالجيلاتين. بعد حوالي خمسة أيام ، قم بإزالة قطع الخزعة المتوسطة والمفرومة عن طريق الشفط ، واشطف الطبق مرتين إلى ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS المعقم. بعد الغسيل الأخير ، أضف 10 مل من الوسط الطازج المكمل بمثبط ROCK ، إلى الطبق ، وأعد الزراعة المشتركة إلى الحاضنة حتى تصل الخلايا إلى 70٪ من التقاء.

لتوسيع الخلايا ، قم بإزالة المغذيات بخمسة ملليلتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن دقيقتين ونصف. اشطف اللوحة بخمسة ملليلتر من PBS الطازج لإزالة الخلايا المغذية العائمة ، وأضف خمسة ملليلتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA لمدة خمس إلى 10 دقائق حتى يتم فك خلايا عينة الخزعة من قاع اللوحة. بعد ذلك ، أوقف التفاعل ب 10 ملليلتر من الوسط الطازج ، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في وسط إعادة برمجة شرطية جديدة للعد ، والآن ، قم بحساب واحدة في 10 إلى خلايا المريء البشرية السادسة في أنبوب مخروطي جديد. أضف 1.2 مرة 10 إلى الخلايا السادسة المشععة 3T3 إلى خلايا المريء ، واجعل الحجم الكلي في الأنبوب يصل إلى 15 مل مع وسيط إعادة برمجة مشروطة جديد. بعد ذلك ، أضف مثبطات ROCK الطازجة إلى الخلايا ، وقم بوضع الزراعة المشتركة على طبق 150 ملم مغطى بالجيلاتين.

لتجميد خلايا المريء لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بإزالة المغذيات وفصل خلايا المريء كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر للطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات عند 1 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من تركيز وسط التجميد. بعد ذلك ، انقل ملليلترين من الخلايا إلى كل كريوفيال مسمى مسبقا ، وقم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل قبل نقلها إلى تخزين النيتروجين السائل على المدى الطويل.

تتشكل مستعمرات الخلايا الظهارية في غضون أربعة إلى خمسة أيام تقريبا ، وستكون محاطة بخلايا مغذية للأرومات الليفية. مع توسع هذه المستعمرات ، ستندمج مع مستعمرات أخرى لتشكيل مستعمرات أكبر. بمجرد أن تصبح الثقافة ملتقية بنسبة 70٪ ، يجب توسيعها.

بعد إزالة الخلايا المغذية ، يمكن تبربسون الخلايا الظهارية الملتصقة وإعادة طلاءها على خلايا مغذية جديدة مشععة. يكشف الخصائص المظهرية لهذه الخلايا عبر qRT-PCR عن تنظيم إضافي ل P63 ، وهي علامة خلية سلفية في نهاية المقطع الأول ، مقارنة بعينة التجسس الحيوي الأولية ، مما يشير إلى أن الخلايا قد أعيد برمجتها إلى حالة تشبه جذع السلف. عندما يتم نقل هذه الخلايا إلى ألواح زراعة الأنسجة الطبيعية ، ينخفض تعبير P63 ويزداد تعبيرات بروتين التقاطع الضيق الأول ، أو TJP1 ، وتعبيرات E-cadherin ، مما يدل على تحول النمط الظاهري من الخلية السلفية إلى الخلية الظهارية الأكثر تمايزا.

يشير تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا بعد المرور إلى أن أكثر من 90٪ من الخلايا إيجابية أيضا ل EpCAM. يوضح تلطيخ التألق المناعي أن الخلايا تحتفظ بعلامتها الظهارية ، وعلامة السلف ، وعلامة التكاثر ، وتعبير بروتين الوصلة الظهارية الضيقة. تم حساب وقت مضاعفة خلايا المريء من مريض غير مريض ليكون حوالي 36 إلى 40 ساعة ، على الرغم من أنه من المحتمل أن يكون وقت مضاعفة الخلايا المريضة أبطأ.

بمجرد إتقانها ، يجب إكمال هذه التقنية في غضون ساعة واحدة تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، تأكد من استخدام تقنية معقمة لمنع التلوث ، وتأكد من العمل بسرعة للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات أخرى ، مثل ثقافة الوحل ، من أجل تقييم المستضدات التي تسبب التهاب المريء أو التسبب في المرض.

بعد التطوير ، سيمهد هذا الاختبار الطريق للباحثين لتحديد المستضدات المحفزة المسببة لالتهاب المريء اليوزيني ، بالإضافة إلى خيارات العلاج الجديدة لعلاج هؤلاء المرضى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتوسيع الخلايا الظهارية للمريء من الخزعات بالمنظار لاستخدامها في دراسة أمراض المريء ، أو إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد. لا تنس أن العمل بالأدوات الحادة والأنسجة البيولوجية يمكن أن يكون خطيرا.

تأكد من التخلص من الأدوات الحادة بشكل صحيح ، واستخدام ممارسات السلامة البيولوجية الجيدة.