MitoCeption: نقل معزولة الإنسان MSC الميتوكوندريا إلى خلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل الميتوكوندريا المعزولة سابقا من الخلايا المانحة مثل الخلايا الجذعية الوسيطة لاستهداف الخلايا مثل الخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التمثيل الغذائي مثل التأثيرات الأيضية والبيولوجية للميتوكوندريا التي يتم نقلها تلقائيا بين الخلايا عن طريق عمليات مثل الأنابيب النانوية الأنفاقية أو الحويصلات الدقيقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم تأثيرات الميتوكوندريا بشكل مستقل عن العوامل الأخرى الموجودة في البيئة الدقيقة مثل السيتوكينات أو المستقلبات وأيضا المركبات الأخرى التي يمكن أن تتهارب أيضا في الأنابيب النانوية الأنفاقية.

لأغراض التصوير ، يمكن تصنيف الميتوكوندريا MSC و GSC بالأصباغ الحيوية قبل نقل الميتوكوندريا بواسطة MitoCeption. للبدء ، بعد وضع العلامات المسبقة على GSCs بالأصباغ الحيوية وفقا لبروتوكول النص ، قم بجمع المجالات العصبية GSC في أنبوب سعة 50 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 270 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم خمسة ملليلتر من HBSS لغسل الخلايا وتدوير الأنبوب مرة أخرى.

استنشق المادة الطافية وبسعة 100 ميكرولتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA أعد تعليق حبيبات GSC برفق. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من 20 مللي مولار كلوريد الكالسيوم في ميكرولترين عند 10 ملليغرام لكل مليلتر من DNase I إلى الأنبوب.

افصل المجالات العصبية باستخدام ماصة P200 لتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل 30 إلى 50 مرة لتجنب تكوين الفقاعات. أضف 10 ميكرولترات من مثبطات التربسين 5٪ في 10 ملليلتر من HBSS إلى الخلايا وقم بالطرد المركزي ل GSCs لمدة سبع دقائق. ثم تخلص من المادة الطافية و 10 ملليلتر من GSC Basal Medium إلى العينة.

الآن ، باستخدام غرفة عد Thoma ، قم بحساب الخلايا قبل الدوران مرة أخرى. أضف الحجم المناسب من وسيط تكاثر GSC للوصول إلى تركيز خلوي من 10 إلى سادس GSCs لكل مليلتر. ثم قم بالبذور 10 إلى GSCs الخامسة لكل بئر من 96 بئر صفيحة.

بالطرد المركزي للوحة بحيث تستقر GSCs في قاع الآبار. افحص الخلايا تحت المجهر. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية.

لإجراء عزل الميتوكوندريا MSC ، ابدأ بضبط درجة حرارة جهاز الطرد المركزي الدقيق إلى أربع درجات مئوية. قم بإعداد أنبوبين سعة 1.5 مليلتر يحملان علامة A و C يحتويان على كواشف لاستخراج الميتوكوندريا. قم بإعداد أنبوبين إضافيين يحملان اسم MSC و MiTo.

احتفظ بالأنابيب على الجليد. قم أيضا بإعداد أنابيب للتخفيفات التسلسلية للميتوكوندريا التي سيتم إعدادها مع تحضير الميتوكوندريا. استخدم 10 مل من PBS الدافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية لغسل الخلايا الجذعية الجذعية.

ثم باستخدام ملليلترين من التربسين الخالي من EDTA ، اغسل الخلايا لمدة 10 ثوان وأضف ملليلترا إضافيا واحدا من التربسين قبل احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. يجب تجنب استخدام EDTA وفقا للبروتوكول ، لا سيما بالنسبة لمعالجة MSC Trypsinization ومثبطات البروتياز المستخدمة في تحضير الميتوكوندريا. استرجع MSCs عن طريق إضافة 10 ملليلتر من Alpha MEM 10٪ FBS ونقل التعليق إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

ثم الطرد المركزي للخلايا. تخلص من المادة الطافية وأضف 10 ملليلتر من Alpha MEM 10٪ FBS إلى حبيبات الخلية. ثم استخدم غرفة عد Malassez لحساب الخلايا الجذعية الجذعية قبل الدوران لأسفل من أربعة إلى خمسة مرات 10 إلى الخلايا الخامسة.

تخلص من المادة الطافية ، وأضف ملليلترا واحدا من Alpha MEM 10٪ FBS إلى حبيبات الخلية وانقل الخلايا إلى الأنبوب المسمى MSC المعد مسبقا مع الاستمرار في إبقائه على الجليد. ثم قم بالطرد المركزي لأنبوب MSC عند 900 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وقم بإزالة جميع الوسائط المتبقية من الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا A مع مثبطات البروتياز الخالية من EDTA إلى الخلايا الجذعية الجذعية والدوامة بسرعة متوسطة لمدة خمس ثوان.

ثم اترك الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين بالضبط. أضف 2.5 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا B وقم بتدوير الخلايا بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان قبل إعادة الأنابيب إلى الجليد. كرر الدوامة كل 30 ثانية لمدة خمس دقائق.

الآن ، أضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الميتوكوندريا C مع مثبطات البروتياز الخالية من EDTA إلى الأنبوب واخلط المحتويات عن طريق إمالة الأنبوب 30 مرة تقريبا. جهاز الطرد المركزي للأنابيب عند 700 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية التي تحتوي على ميتوكوندريا MSC إلى أنبوب MiTo المعد مسبقا.

الطرد المركزي العينة عند 3 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، استخدم 200 ميكرولتر من الكاشف C لشطف حبيبات الميتوكوندريا. ثم قم بتدوير التعليق عند 12 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لتكسير العضيات.

لنقل الميتوكوندريا MSC المعزولة إلى GSCs ، أضف 200 ميكرولتر من وسط تكاثر GSC المبرد مسبقا إلى حبيبات الميتوكوندريا. قم بتخفيف مستحضر الميتوكوندريا في وسط تكاثر GSC للسماح باستمرار بإضافة 20 ميكرولترا من تعليق الميتوكوندريا إلى GSCs. بعد ذلك ، أضف الميتوكوندريا ببطء بالقرب من قاع البئر.

للتحكم في تسرب الصبغة الحيوية للميتوكوندريا MSC ، أضف نفس الكمية من مستحضر الميتوكوندريا إلى آبار صفيحة 96 بئر تحتوي على وسط تكاثر GSC فقط. الطرد المركزي للألواح عند 1،500 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم ضع الثقافات على الفور عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، لتحليل آبار التحكم لتسرب الصبغة الحيوية ، تقوم خلايا GSC بالبذور كما هو موضح سابقا ، بالطرد المركزي لللوحة ، ثم احتضان المزارع عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. جهاز طرد مركزي لوحة البئر 96 التي تحتوي على الميتوكوندريا فقط. ثم استنشق الوسط من لوح البئر GSC 96 واستبدله بطافي الميتوكوندريا.

احتضان GSCs مع طاف الميتوكوندريا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. أخيرا ، قم بإجراء تحليل لنقل الميتوكوندريا وتحليل FACS والتصوير متحد البؤر وفقا لبروتوكول النص. الخلايا الجذعية السلفية هي خلايا جذعية سرطانية تزرع كخلايا عصبية للحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية.

قبل نقل الميتوكوندريا مباشرة ، يتم زرعها كخلايا مفردة للسماح بكفاءة نقل عالية للميتوكوندريا وفي اليوم التالي كما هو موضح هنا ، لوحظ أن الخلايا تشكل المجالات العصبية مرة أخرى. في هذا الشكل ، يمكن رؤية ميتوكوندريا MSC المسماة بالفلورسنت مترجمة داخل Gb4 GSCs. تظهر ميتوكوندريا MSC في جميع أنحاء GSCs على غرار الميتوكوندريا GSC.

يمكن ملاحظة نقل الميتوكوندريا MSC لمعظم GSCs في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من الصور متحدة البؤر GSC يؤكد التوطين بين الخلايا لميتوكوندريا MSC المنقولة. سمح وضع العلامات المسبقة على GSCs مع كل من الأصباغ الحيوية للميتوكوندريا الخلوية الزرقاء والحمراء بتصور توطين الميتوكوندريا MSC المنقولة التي شوهدت باللون الأخضر بالنسبة إلى الميتوكوندريا GSC الذاتية. كما هو موضح هنا ، أدى MitoCeption مع زيادة كميات الميتوكوندريا الفلورية MSC إلى زيادة إشارات FACS وبعدة أوامر من حيث الحجم أعلى من إشارة التحكم.

أظهر بروتوكول نقل الميتوكوندريا المقدم هنا الذي تم إجراؤه على GSCs أحادية الخلية استجابة تعتمد على الجرعة ومتوسط نسبي لشدة التألق. أخيرا ، على الرغم من أن نقل الميتوكوندريا MSC قد تحقق أيضا على المجالات العصبية GSC ، إلا أن فعالية النقل إلى GSCs في ظل هذه الظروف كانت أقل مقارنة بالميتوكوندريا المنقولة إلى GSCs التي تم زرعها لأول مرة كخلايا مفردة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على تحضير الميتوكوندريا على الجليد في جميع الأوقات. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل FACS ، والفحص المجهري متحد البؤر ، و QPCR على الحمض النووي للميتوكوندريا من أجل تصور وقياس نقل الميتوكوندريا MSC إلى الخلايا المستهدفة. يمكن أيضا إجراء دراسات وظيفية لتحديد التأثيرات البيولوجية للميتوكوندريا المنقولة.

ضع في اعتبارك أن هذه الدراسات سيتم إجراؤها بشكل عام بكميات أقل من الميتوكوندريا من تلك المستخدمة لتصور نقل الميتوكوندريا. ستسمح هذه التقنية باستكشاف النتائج والتأثيرات البيولوجية للميتوكوندريا التي تنتقل تلقائيا بين الخلايا إما في الظروف الفسيولوجية أو المرضية الطبيعية ، وبالتالي ستساهم في تطوير علاجات علاجية جديدة.