عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا من العضلات الهيكلية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي وتحديد معدلات التنفس لمجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندرية I و II و IV. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الطاقة الحيوية للميتوكوندريا، مثل الأمراض والمتلازمات المرتبطة بخلل وظائف الميتوكوندريا، مثل الأمراض العصبية المتنوعة وتسمم الدم والاضطرابات المرتبطة بالعمر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي غياب معظم العوامل الخلوية في تحضير الميتوكوندريا المعزولة، والتي قد تتدخل في تحليل وظائف الميتوكوندريا. ستقوم ساندرا نانسوز، الفنية من مختبري، بشرح الإجراء.

لبدء هذا الإجراء، احصل على وعاء يحتوي على عينات من العضلات الهيكلية كما هو موضح في البروتوكول النصي. ضع الوعاء في دلو من الثلج. وباستخدام مقص دقيق، قم بتقطيع العضلات إلى قطع يتراوح حجمها بين 1 إلى 2 مليمتر.

بعد ذلك، اشطف النسيج المفروم مرتين باستخدام محلول عزل بارد جداً، مع استخدام 20 milliliters لكل غسلة. علّق النسيج المغسول في 10 milliliters من محلول العزل لكل جرام من النسيج، ثم أضف خمس milligrams من protease-G tissue. ثم ضع الكأس في حمام ثلجي مع محرك مغناطيسي وحركه لمدة 10 minutes.

بعد ذلك، قم بتخفيف المعلق بإضافة 10 ملليلتر أخرى من محلول العزل المنظم المدعم بـ 0.2% من BSA منزوع الدسم لكل جرام من النسيج. بعد ذلك، قم بسكب كل محلول العزل المنظم من الكأس. اغسل النسيج مرتين بمحلول العزل المنظم المبرد والمُدعم بـ 0.2% BSA باستخدام 20 ملليلتر لكل غسلة.

بعد ذلك، أعد تعليق النسيج في 10 ملليلتر من محلول عزل مُدعم بـ BSA لكل جرام من النسيج. استخدم مجانسًا زجاجيًا شبه أوتوماتيكي بمدقة فضفاضة لتجنيس النسيج. تالياً، انقل المادة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي وقم بإجراء الطرد المركزي عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

باستخدام ماصة مصلية، تخلص من السائل الطافي. أعد تعليق الراسب باستخدام 10 milliliters من وسط العزل المبرد بالثلج والمُدعم بـ BSA لكل جرام من النسيج. قم بطرد المعلق مركزياً عند 350 times G لمدة 10 minutes عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد ذلك، استخدم ماصة سيرولوجية لحفظ السائل الطافي مع التخلص من الراسب. قم بترشيح السائل الطافي في دورق بيكر محفوظ على الثلج من خلال طبقتين من الشاش. انقل المعلق المرشح إلى أنبوب طرد مركزي وقم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 7,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

ثم تخلص من الطافي. أعد تعليق راسب الميتوكوندريا الخام في خمسة ملليلتر من محلول عزل منظم مدعم بـ BSA لكل جرام من النسيج. قم بطرد هذا المعلق مركزياً بقوة 7,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 20 milliliters من منظم الغسيل. قم بالطرد المركزي عند 7,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. كرر عملية إعادة التعليق والطرد المركزي هذه مرة أخرى.

بعد ذلك، تخلص من الطافي وأعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول الغسل المنظم. حدد تركيز البروتين باستخدام أي طريقة قياسية. ثم، احفظ معلق الميتوكوندريا المركز على الثلج حتى يحين وقت إجراء فحوصات قياس التنفس.

للبدء، أعد تعليق المركز الميتوكوندري في محلول التنفس المنظم للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.4 mg/mL من بروتين الميتوكوندريا. بعد ذلك، اسحب وسط التنفس من غرفة جهاز الأوكسيغراف (oxygraph) المعايرة للهواء. أضف 2.1 mL من معلق الميتوكوندريا المعزولة.

ضع سدادة لإغلاق غرفة جهاز قياس الأكسجين (oxygraph). ثم قم بتقليب معلق الميتوكوندريا باستمرار بسرعة 700 RPM عند 37 درجة مئوية. سجل التنفس الخلوي عند الخط القاعدي لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة.

لبدء التنفس المعتمد على المعقد I، قم بحقن 12.5 µL من المالات بتركيز 0.8 M في غرفة جهاز قياس الأكسجين (oxygraph) المحضرة بعالق الميتوكوندريا المعزولة، وذلك عبر منفذ الحقن التيتانيوم الموجود في السدادة. بعد ذلك، احقن 10 µL من الغلوتامات بتركيز 2 M. قم بتسجيل التنفس الخلوي لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة.

بعد ذلك، يتم حقن 10 µL من ADP بتركيز 0.05 molar في الغرفة عبر منفذ الحقن. سجل التنفس الخلوي حتى تزداد إشارة تدفق الأكسجين ثم تنخفض وتستقر. وبالنسبة للتنفس المعتمد على المعقد II، يتم حقن 2 µL من rotenone بتركيز 0.2 millimolar في غرفة oxygraph مُجهزة بمعلق ميتوكوندريا معزولة.

قم بتسجيل التنفس الخلوي حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة. بعد ذلك، قم بحقن 20 µL من succinate بتركيز 1 M. سجل التنفس الخلوي حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة.

بعد ذلك، احقن 10 µL من ADP بتركيز 0.05 molar في الغرفة عبر منفذ الحقن. سجل التنفس الخلوي حتى تزداد إشارة تدفق الأكسجين ثم تنخفض وتستقر. وبالنسبة للتنفس المعتمد على المعقد IV، احقن 2.5 µL من ascorbate بتركيز 0.8 millimolar في غرفة oxygraph مجهزة بمعلق ميتوكوندريا معزول.

بعد ذلك، احقن فوراً 2.5 µL من TMPD بتركيز 0.2 M و 10 µL من ADP بتركيز 0.05 M. سجل التنفس الخلوي حتى يتم الحصول على إشارة تدفق أكسجين مستقرة. ثم احقن 10 µL من أزيد الصوديوم بتركيز 1 M.

قم بتسجيل التنفس الخلوي حتى تنخفض إشارة تدفق الأكسجين، ثم تستقر. في هذه الدراسة، يتم عزل الميتوكوندريا السليمة من العضلات الهيكلية، ثم تُقاس معدلات التنفس المعتمدة على المعقد I (Complex I) عبر قياس التنفس عالي الدقة.

كما يمكن ملاحظة ذلك، فإن معدل التنفس الميتوكوندري يزداد فور إضافة ADP. ثم ينخفض معدل التنفس بعد استنفاد ADP إلى مستويات مشابهة لتلك التي لوحظت قبل إضافة ADP. يشير هذا إلى أن النسبة بين الحالة 3 والحالة 4، والمعروفة باسم نسبة التحكم التنفسي، أو RCR، عالية، وأن سلامة الميتوكوندريا محفوظة جيداً خلال إجراء عملية العزل.

يتم بعد ذلك رصد معدلات التنفس المعتمدة على المعقد II عن طريق تثبيط التنفس المعتمد على المعقد I باستخدام الروتينون وحقن السكسينات كمادة ركيزة للمعقد II. ثم يُضاف ADP، مما يؤدي إلى زيادة فورية في التنفس. وبمجرد استنفاد ADP، ينخفض التنفس إلى مستويات مماثلة لتلك الملاحظة قبل إضافة ADP، مما يشير إلى ارتفاع نسبة RCR، وهو ما يدل على أن سلامة الميتوكوندريا قد حُفظت جيداً أثناء عملية العزل.

يتم رصد معدلات التنفس المعتمدة على المعقد IV عن طريق إضافة الأسكوربات، وTMPD، وADP. بعد ذلك، يتم إضافة أزيد الصوديوم لتثبيط المعقد IV. ويُفسر الفرق في استهلاك الأكسجين قبل إضافة أزيد الصوديوم وبعدها على أنه التنفس الحقيقي للمعقد IV. ويشير معدل التنفس العالي المعتمد على المعقد IV الملحوظ في الحالة 3 إلى أن سلامة الميتوكوندريا قد حُفظت بشكل جيد أثناء إجراء عملية العزل.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في أقل من ساعة ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء معايرة لمستشعرات الأكسجين مسبقاً قبل عملية التجانس. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل قياسات محتوى ADP الخلوي، وجهد الغشاء الميتوكوندري، والنشاط الإنزيمي لـ ATP synthase، بالإضافة إلى مستويات الركيزة، وذلك للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت التغيرات في معدلات التنفس تعود إلى نقص في ركيزة الميتوكوندريا، أو جهد الغشاء، أو انخفاض النشاط الإنزيمي لـ ATP synthase.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل المتقدرات من العضلات الهيكلية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي، وكيفية قياس معدلات التنفس للمجمعات المتقدرية I و II و IV باستخدام قياس التنفس عالي الدقة. مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال أيض الطاقة في المتقدرات لاستكشاف وظيفة طاقة المتقدرات في مجالات مثل الأمراض المتقدرية الوراثية، والاعتلالات العضلية، وإصابة إعادة التروية بنقص التروية في المتقدرات المعزولة. تذكر أن العمل بمواد مثل antimycin A و rotenone و sodium azide و FCCP يمكن أن يكون خطيرًا للغاية.

ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.