التسامي DAN مصفوفة للكشف والتخيل من Gangliosides في الجرذ أنسجة المخ لMALDI التصوير قياس الطيف الكتلي

الهدف العام لبروتوكول التسامي هذا هو توفير عملية تحضير عينة مفصلة وسهلة المتابعة ، للكشف عن العقد في تجارب قياس الطيف الكتلي للتصوير MALDI. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، بما في ذلك التوزيع التشريحي ووظيفة العقد ، سواء في الدماغ السليم أو في أمراض الدماغ. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تكييفها للتصوير عالي الجودة للعديد من أنواع الدهون ، وتعديلات قليلة على البروتوكول.

لبدء هذا الإجراء ، قم باستخراج أنسجة المخ من الجرذ واستعد للتجميد كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم ضع الأنسجة في ناظم البرد. قسم الأنسجة حتى الموقع التشريحي المطلوب.

تأكد من أن سمك القطع يتراوح بين ثمانية و 12 ميكرون. باستخدام شريط ناظم البرد المضاد للدحرجة ، قم بتقسيم قسم الأنسجة المسطحة ببطء. يمكن أن تحدث ثقوب أو علامات على الأنسجة إذا كان وضع قضيب اللفة غير صحيح أو إذا كانت الشفرة باهتة.

انقل الأنسجة إلى وسط منصة التقطيع باستخدام فرش طلاء نظيفة. لرسم خريطة للأنسجة ، قم بتجميد الشرائح الموصلة أو الألواح المعدنية عن طريق وضعها في ناظم البرد أثناء التقطيع. عندما يتم تجميد الشريحة تماما ، انقل أنسجة المقطع بعناية إلى الخدمة الموصلة للشريحة باستخدام فرش طلاء نظيفة.

بمجرد وضع كل قسم من الأنسجة بشكل صحيح على الشريحة ، ضع إصبعا أسفل الشريحة المقابلة للمنديل واضغط حتى يذوب القسم. ثم ضع الشرائح مع الأنسجة في مجفف لمدة خمس إلى 10 دقائق. بدلا من ذلك ، استخدم شريحة دافئة واضغط عليها برفق ، بحيث يكون الجانب الموصل لأسفل ، مقابل أقسام الأنسجة المسطحة.

العمل في غطاء الدخان ، ضع حماما رمليا في وعاء من الألومنيوم على لوح تسخين. يجب أن يكون لوح التسخين على رافعة مقصية معدنية لمساحة السطح المناسبة. قم بتشغيل لوح التسخين واضبط درجة الحرارة على 140 درجة مئوية.

استخدم مسبار التغذية المرتدة لدرجة الحرارة لمراقبة درجة حرارة الرمل طوال التجربة ، وضمان اتساق درجة الحرارة. بعد ذلك ، ضع 300 ملليغرام من مصفوفة DAN على السطح السفلي لجهاز التسامي. انشر المصفوفة في طبقة متساوية في وسط الجهاز إلى العرض والطول التقريبي للشريحة التي يتم تساميها.

ضع صفيحة معدنية على السطح الداخلي للجهاز مع اتصال اللوحة بشكل مباشر بالجزء السفلي من المكثف. قم بلصق شريحة اختبار فارغة قطريا عبر سطح اللوحة المعدنية ، مع وضع شريط على الحواف الخارجية للشريحة. قم بتوصيل الأجزاء العلوية والسفلية من الجهاز بحلقة مطاطية في المنتصف لضمان الإغلاق الكامل.

ضع مفصلا معدنيا على شكل حرف U حول مركز الجهاز ، وشد الرذائل حتى يتم إغلاق النصف العلوي والسفلي من الجهاز معا بإحكام. ثم ضع الجهاز في الحلقة المعدنية حول الحمام الرملي. بعد ذلك ، ضع حفنة من الثلج المجروش في المكثف.

املأ المكثف من ربع إلى نصف ممتلئ بالماء البارد لعمل طين ثلجي. سوف يبرد طين الجليد الصفيحة المعدنية داخل الجهاز ، وبالتالي تلتصق بها الشريحة. انتظر خمس دقائق على الأقل حتى تصل درجة الحرارة إلى حالة مستقرة.

ثم اسكب 300 مل من الميثانول في حاوية المصيدة الباردة وضع الأواني الزجاجية في الحاوية. قم بتوصيل مضخة التفريغ بإخراج المصيدة الباردة باستخدام أنابيب مطاطية. استخدم قطعة أخرى من الأنابيب المطاطية لتوصيل مدخلات المصيدة الباردة بجهاز التسامي.

تأكد من أن الأنبوب مؤمن بإحكام باستخدام المشابك المعدنية. استخدم مضخة التفريغ لتوصيل فراغ من 30 إلى 50 ملليتور. اترك المضخات تعمل لمدة خمس دقائق على الأقل لتحقيق توازن الضغط.

قم بإسقاط قطعتين إلى ثلاث قطع صغيرة من الثلج الجاف في الإيثانول ، في قاع حاوية المصيدة الباردة. تساعد مصيدة البرد على منع جزيئات المصفوفة من التراكم في مضخة التفريغ. قد تحتاج الرذائل الموجودة على الحلقة U لجهاز التسامي إلى شد بمجرد تشغيل مضخة التفريغ بسبب انخفاض الضغط في الجهاز.

تأكد من استقرار درجة حرارة الحمام الرملي عند 140 درجة مئوية. تحقق أيضا من أن المكنسة الكهربائية قيد التشغيل وأن الجهاز مؤمن في الحلقة المعدنية O فوق الحمام الرملي مع توصيل جميع الأنابيب. اضبط المؤقت لمدة سبع دقائق ولكن لا تبدأ المؤقت.

ارفع ببطء رافعة المقص وحمام الرمل حتى جهاز التسامي حتى يكون مفصل U للتسامي أعلى بكثير من الحلقة المعدنية O. تسمح هذه المساحة الإضافية بتعديل الجهاز على الرمال. اضغط بسرعة على التسامي برفق على سطح الرمال للتأكد من أن الجهاز يجلس بالتساوي على الرمال.

وبعد ذلك ، ابدأ المؤقت على الفور. عندما يصدر صوت المؤقت ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ وقم بخفض رافعة المقص بعناية حتى لا يلامس التسامي الحمام الرملي ويجلس بإحكام في الحلقة المعدنية O. قم بفك صمام microvent ببطء لتحرير الضغط في الجهاز.

بفك المشبك المعدني حول الأنبوب المطاطي لجهاز التسامي ، وابدأ ببطء في فك الأنبوب. بمجرد فك الأنبوب المطاطي قليلا ، قم بثني الأنبوب إلى جانب واحد للسماح للضغط المتبقي بالهروب. عندما يعود الضغط المحيط ، قم بإزالة الأنبوب المطاطي بعناية من جهاز التسامي.

بعد ذلك ، قم بفك الرذائل الموجودة على مفصل U للجهاز وإزالتها. افصل بعناية نصفي جهاز التسامي واسحب الشريحة من أعلى الأواني الزجاجية الداخلية. افحص الشريحة لتأكيد توزيع المصفوفة المتساوي.

إذا كان توزيع المصفوفة وكمية المصفوفة المتسامية كافيا ، فقم بلصق شريحة جديدة بأنسجة على الجزء الداخلي من التسامي وكرر عملية التسامي. تابع إجراء التصوير والتحليل كما هو موضح في بروتوكول النص. يعرض الطيف الكتلي وفرة أيونية من الأنوليت ضمن نطاق كتلة 1000 إلى 2000.

يتم تصنيف العقد الرئيسية من السلسلة A على طول الطيف. تظهر هنا الصورة الجزيئية المقابلة للجانجليوسيدات في دماغ الفئران. تظهر الصورة الجزيئية التوزيع التشريحي للعديد من أنواع العقد العقدية من خلال الترميز اللوني ، والتي تم تراكبها والألوان الزائفة باستخدام برنامج ImageJ.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، حيث توجد العديد من المتغيرات في عملية إعداد العينة والتي يمكن أن تؤثر على جودة نتائج IMS التي غالبا ما يتم استبعادها من البروتوكولات المبلغ عنها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة مقدار المصفوفة التي يتم تساميها بعد كل تجربة ، وتعديل وقت التسامي وفقا للشريحة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف دور الدهون الغشائية مثل العقدة ، بعد إصابة الدماغ ومرض نير جون وعملية الشيخوخة الطبيعية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على وفرة الدهون في الدماغ وتوزيعها التشريحي ، ويمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى ، بما في ذلك الأنسجة خارج الدماغ ، وحتى نماذج النباتات والحشرات. يمكن أن يكون العمل مع الجذور التالفة خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات والأقنعة وحماية العين عند تنفيذ هذا الإجراء.