التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1 ⁺ البنكرياس أسلاف

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد NKX6.1 بكفاءة عن أسلاف البنكرياس من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في المختبر عن طريق تمييز الخلايا من خلال أربع مراحل رئيسية من تطور البنكرياس. من خلال تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات من خلال أربع مراحل رئيسية لتطوير البنكرياس ، يوفر هذا البروتوكول نموذجا لدراسة تطور البنكرياس البشري في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على البروتوكولات الحالية هي أننا قادرون على توليد نسب عالية من الخلايا السلفية للبنكرياس الإيجابية NKX6.1 باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

بالنظر إلى أن أسلاف البنكرياس لديها القدرة على توليد خلايا شبيهة ببيتا المنتجة للأنسولين ، فإن هذه التقنية ستمنحنا الفرصة لتطوير خلايا لعلاج مرض السكري واكتشاف الأدوية ونمذجة الأمراض. في اليوم صفر ، ابدأ التمايز عن طريق استبدال وسائط استبدال مصل KnockOut بوسائط تمايز اليوم الصفر. ثم في يوم واحد ويومين ، قم بهز اللوحة برفق لإزالة أي خلايا ميتة من الطبقة الأحادية قبل شفط الوسائط.

بعد ذلك ، استبدله بوسائط التمايز من اليوم الأول إلى الثاني. في اليوم الثالث ، احصد الخلايا لقياس التدفق الخلوي. إذا كانت الخلايا تعبر عن أكثر من 90٪ من CXCR4 و CD117 ، فقد تم الوصول إلى الكفاءة.

ثم رج اللوحة برفق لإزالة أي خلايا ميتة من الطبقة الأحادية قبل الشفط واستبدلها بوسائط التمايز في اليوم الثالث إلى الخامس. من المهم ضمان الحث الفعال للنهائي تحت الجلد بحلول اليوم الثالث عن طريق قياس التدفق الخلوي. إذا كانت النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن كل من CXCR4 و CD117 أقل من 90٪ ، فمن المحتمل أن يتم اختراق التمايز لأسلاف البنكرياس.

في اليومين السادس والسابع ، استبدل الوسيط بوسائط تمايز اليوم السادس إلى السابع. في الأيام الثامنة و10 و12، استبدل الوسيط بوسائط تمايز من اليوم الثامن إلى 12. ثم في اليوم 13 ، قم بحصاد الخلايا لقياس التدفق الخلوي لتحديد تعبير PDX1 و NKX6.1.

لحصاد الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، افصل الخلايا بمحلول التربسين التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة محلول التربسين وأعد تعليق الخلايا المفردة في 1,000 ميكرولتر من مخزن الفاكس مع 30 ميكرولتر من DNA One. ثم قم بتصفية الخلايا باستخدام مصفاة خلية شبكية من النايلون 35 ميكرومتر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

الطرد المركزي للخلايا عند 455 مرة جم لمدة خمس دقائق قبل تحضير الخلايا للتلوين الحي أو الثابت. الآن أعد تعليق الخلايا في 1,000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس. انقل 200 ميكرولتر إلى بئرين من لوح 96 بئر لكل من العينات غير الملطخة والملطخة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين ، وبعد ذلك قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ، وصمة عار الخلايا بجسم مضاد مترافق أولي في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وحمايتها من الضوء. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين ، وبعد دقيقتين قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة. بعد ذلك ، أعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس.

ثم الطرد المركزي اللوحة 931 مرة غرام لمدة دقيقتين. وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة. بعد ذلك ، أعد تعليق العينات في 300 إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ، وانقلها إلى أنابيب الاختبار الدقيقة سعة ملليلتر واحد أو الأنابيب السفلية المستديرة التي يبلغ حجمها خمسة مليلتر وقم بتشغيل العينات على مقياس التدفق الخلوي.

إذا تعذر تشغيل العينات على الفور ، فقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية وحمايتها من الضوء. في هذا الإجراء ، أعد تعليق حبيبات الخلية في التثبيت التجاري ومحلول Isation القابل للاختراق لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية. بعد 24 ساعة ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 455 مرة جم لمدة خمس دقائق ، ثم أعد تعليقها في 400 ميكرولتر من محلول غسيل التجعيد التجاري.

بعد ذلك ، قم بنقل 200 ميكرولتر من العينة في بئرين من لوحة 96 بئر للتحكم في IGG وتلوين PDX1 ، NKX6.1 ، وجهاز الطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين. ثم أعد تعليق كريات الخلية في 100 ميكرولتر من محلول غسيل التجعيد التجاري الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية أو المضادة ل NKX61 أو النظائر المضادة. احتضنها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من محلول غسيل التجعيد التجاري. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة.

ثم أعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من محلول غسيل بيرم الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة وحمايتها من الضوء. بعد المنزل ، قم بالطرد المركزي للوحة 931 مرة جم لمدة دقيقتين ، ثم قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ، وبعد ذلك ، أعد تعليق العينات في 100 ميكرولتر من محلول غسيل بيرم التجاري ، وقم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين ، وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة. بعد ذلك ، أعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من محلول غسيل بيرم التجاري وقم بالطرد المركزي للوحة عند 931 مرة جم لمدة دقيقتين مرة أخرى قبل إزالة المادة الطافية.

بعد ذلك ، أعد تعليق العينات في 300 إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس ونقلها إلى أنابيب اختبار منفصلة سعة مليلتر واحد أو أنابيب سفلية مستديرة بسعة خمسة مليلتر لتشغيل قياس التدفق الخلوي. يظهر هنا سيماتيك لتحريض سلف البنكرياس من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مما يشير إلى يوم التمايز ، وتطور المرحلة العقلية ، والوسائط الأساسية والسيتوكينات المضافة في كل مرحلة. وهنا صور تباين الطور في المراحل الرئيسية لتمايز البنكرياس.

تم تمييز خلايا H1 وفقا لبروتوكول التمايز الرباعي الموضح. مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية غير المتمايزة في اليوم صفر ، الجلد الداخلي النهائي في المرحلة الأولى ، والأمعاء الخلفية الرابعة في المرحلة الثانية ، والجلد الداخلي البنكرياس في المرحلة الثالثة ، و NKX6.1 أسلاف البنكرياس الإيجابية في المرحلة الرابعة. يوضح هذا الشكل اليوم الثالث من مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية لتلوين الأجسام المضادة CXCR4 PE و CD117 APC.

ها هي العينة غير الملوثة وها هي العينة الملطخة. ويوضح هذا الشكل مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية في اليوم 13 للمرحلة الرابعة من الخلايا السلفية للبنكرياس المشتقة التي تعبر عن NKX61 و PDX1. هذا هو التحكم IGG وهذه هي العينة الملطخة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 13 يوما. ومع ذلك ، قد يختلف هذا اعتمادا على خط الخلية المستخدم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم اختبار جميع العوامل بسبب تباين الدفعة إلى الدفعة.

بعد اتباع الإجراء ، يمكن تمييز الخلايا السلفية للبنكرياس الإيجابية NKX6.1 إلى خلايا شبيهة ببيتا المنتجة للأنسولين باستخدام بروتوكولات أخرى منشورة. يوفر هذا منصة لدراسة نضوج خلايا بيتا وتطورها في المختبر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التمييز بكفاءة بين الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى أسلاف البنكرياس عن طريق أخذ الخلايا عبر أربع مراحل رئيسية من التطور.