بين الخلايا تلطيخ والتدفق الخلوي لتحديد الخلايا الليمفاوية مجموعات فرعية ضمن الفئران الأورطي، الكلى والغدد الليمفاوية في نموذج من ارتفاع ضغط الدم

الهدف العام من هذا البروتوكول هو الحصول على معلقات أحادية الخلية من الشريان الأورطي والكلى والغدد الليمفاوية في الفئران لتحديد وتوصيف الخلايا المناعية في نموذج لارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين II. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض القلب والأوعية الدموية ، مثل مجموعتين فرعيتين من الخلايا الليمفاوية تعزز تطور ارتفاع ضغط الدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد وقياس مجموعات الخلايا المناعية الفرعية في الأعضاء الصلبة على مستوى الخلية الواحدة.

قبل البدء في الإجراء ، قم بتطهير صدر الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم استخدم المقص لفتح الجلد وجدار الصدر بعناية لكشف القلب. لنشر الأوعية الدموية ، قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن وحقن ما لا يقل عن 10 مل من PBS البارد بمعدل واحد مليلتر في الثانية تقريبا في قمة البطين الأيسر.

عندما يتم تبيض جميع الأعضاء ، استخدم ملقطا ناعما لإزالة الغدد الليمفاوية التي تستنزف الأبهر البطني ، مع الحرص على عدم تمزق الكبسولات. تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة الكليتين بمقص ناعم. ثم استخدم مقصا منحنيا ناعما لتشريح الشريان الأورطي الصدري والبطني بالكامل بدءا من القلب وينتهي بالتشعب الحرقفي ، مع الحرص على إبقاء الدهون المحيطة بالأوعية الدموية ملتصقة بالشريان الأورطي.

بعد ذلك ، انقل الكلى إلى أنبوب تفكك يحتوي على 10 مل من محلول هضم الكلى واستخدم مفككا شبه آلي لتفكيك أنسجة الكلى ميكانيكيا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. في نهاية التفكك ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية تحت الدوران المستمر. بعد 20 دقيقة ، أوقف على الفور الهضم الأنزيمي باستخدام وسيط RPMI 1640 البارد المكمل بنسبة 5٪ FBS وقم بتصفية ملاط الأنسجة الناتج من خلال مصفاة 40 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

استخدم المكبس من حقنة سعة مليلتر واحد لتفكيك الأنسجة المتبقية. ثم تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة 36٪ ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.

ضع طبقة برفق من ثلاثة ملليلتر من وسط التدرج الكثافة بنسبة 72٪ تحت الخلايا ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات ، وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ستكون الخلايا المناعية موجودة في الواجهة. قم بإزالة الطبقة الصفراء العلوية التي تحتوي على الحطام الخلوي ثم ارفع الحجم إلى 15 مل باستخدام PBS البارد.

رج العبوة جيدا لتحطيم التدرج ثم اغسل الخلايا بالطرد المركزي. لعزل الخلايا المناعية للأبهر ، انقل الشريان الأورطي إلى أنبوب سعة ملليلتر يحتوي على مليلتر واحد من محلول هضم الشريان الأورطي المحضر حديثا على الثلج واستخدم مقصا ناعما لفرم الشريان الأورطي بأكمله إلى قطع رفيعة. ثم احتضان الشظايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة من الدوران المستمر.

في نهاية عملية الهضم ، أضف RPMI البارد المكمل بنسبة 5٪ FBS بخمسة أضعاف حجم محلول الهضم وقم بتصفية ملاط الأنسجة الناتج من خلال مصفاة 40 ميكرون. ثم اجمع التعليق أحادي الخلية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في RPMI جديد باستخدام FBS. لتوليد معلق أحادي الخلية من الغدد الليمفاوية التي تستنزف الأبهر ، انقل الغدد الليمفاوية إلى مصفاة 40 ميكرون في طبق زراعة أنسجة 60 × 15 ملم واستخدم مكبس حقنة سعة مليلتر واحد لتفكيك الأنسجة.

ثم اغسل المصفاة بملليلترين من RPMI بالإضافة إلى FBS وانقل الخلايا المحررة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. لتحفيز الخلايا ، اضبط أولا كل تعليق خلية على واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر في وسط زراعة الخلية. ثم أضف ميكرولترين من كوكتيل تنشيط الخلية إلى كل مجموعة من الخلايا لكل مليلتر واحد من المتوسط.

بعد ذلك ، قم بنقل مرة إلى اثنتين في 10 إلى خلايا الأبهر أو الكلى السادسة لكل بئر في صفيحة مكونة من 12 بئرا ومرة إلى مرتين في 10 إلى خلايا العقدة الليمفاوية السادسة لكل بئر في صفيحة مكونة من 24 بئرا. ضع الألواح في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ثم انقل الخلايا إلى أنابيب البوليسترين FACS المناسبة وقم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام عازلة FACS جديدة تحت نفس ظروف الطرد المركزي ، قم بحظر الربط السطحي وغير المحدد بكتلة FC وغسل الخلايا في PBS. أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من PBS الطازج وصمة عار الخلايا بميكرولتر واحد من بقعة حيوية أمين تفاعلية غير منفذة للخلية لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين أخريين في واحد إلى ملليلتر من المخزن المؤقت FACS وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المناسب لتلوين سطح الخلية.

بعد 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ومحمية من الضوء ، اغسل الخلايا مرتين أخريين في ملليلترين من محلول FACS الطازج ، وقم بإصلاح الخلايا ونفاذها باستخدام مجموعة أدوات التثبيت والنفاذية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بمزيج الأجسام المضادة داخل الخلايا محل الاهتمام واغسل الخلايا في المخزن المؤقت FACS مرة أخرى. لتحليل قياس التدفق الخلوي لإنتاج السيتوكين المحفز داخل الخلايا ، قم أولا بتشغيل أنابيب التحكم غير الملطخة والملطخة المفردة لضبط التداخل الطيفي ، متبوعا بعناصر التحكم الفلورية ناقص واحد لكل فلوروفور في اللوحة.

عندما يتم تعيين معلمات تحليل التألق الأساسية ، استخدم مخطط منطقة التشتت الأمامي جنبا إلى جنب لتعيين البوابة الأساسية للكشف عن أعداد الكريات البيض ، متبوعا ببوابة لاستبعاد الخلايا الميتة وفقا لافتقارها إلى تعبير البقعة للبقاء. ارسم منطقة التشتت الأمامية مقابل ارتفاع التشتت الأمامي والبوابة لاستبعاد المضاعفات. يمكن بعد ذلك التعرف على الكريات البيض من خلال تعبير CD45 الخاص بها.

لتحديد وجود IL-17A أو IL-17F التي تنتج الخلايا التائية مع كلية الفئران أو الشريان الأورطي ، يمكن تحضير معلقات أحادية الخلية كما هو موضح للتو لتحليل التحكم الفلوري ناقص واحد لكل سيتوكين. كما هو متوقع ، هناك عدد قليل جدا من الخلايا إيجابية ل IL-17A أو IL-17F في عناصر التحكم الفلورية ناقص واحد ، مما يسمح بالتمييز الدقيق للإشارات الإيجابية مقابل الإشارات السلبية لضبط البوابات بشكل صحيح لتحديد الخلايا الإيجابية IL-17A أو IL-17F في العينات التجريبية. يكشف التلوين التمثيلي داخل الخلايا للخلايا التائية المعزولة من الكلى والشريان الأورطي للفئران البرية المملوءة بمركبة أو أنجيوتنسين II عن وجود مجموعة فرعية من الخلايا التائية التي تعبر عن IL-17A أو IL-17F داخل كلا الأنسجة.

علاوة على ذلك ، يوضح التلوين داخل الخلايا للخلايا التائية من الغدد الليمفاوية التي تستنزف الأبهر أن الخلايا التائية الإيجابية CD8 تعبر عن إنترفيرون جاما و T-bet بعد تحفيز الأنجيوتنسين II. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ست إلى تسع ساعات اعتمادا على عدد الأنسجة التي تتم معالجتها. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم العمل بسرعة وكفاءة لتقليل موت الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد معلق أحادي الخلية من كلية الفئران والشريان الأورطي والغدد الليمفاوية وتوصيف وتحديد مجموعات فرعية للخلايا المناعية من هذه الأعضاء. تسمح هذه التقنية لفسيولوجيا القلب والأوعية الدموية والكلى باستكشاف التغيرات في مجموعات الخلايا المناعية التي قد تساهم في ارتفاع ضغط الدم والأمراض الأخرى المؤيدة للالتهابات.