في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا الأرومة الغاذية البشرية باستخدام مورفوجينيك العظام 4 ومثبطات مسارات الإشارات النشطة والعقدية لدراسة الأحداث المبكرة لتكوين المشيمة البشرية ووظيفتها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة وظائف الخلايا الأرومة الغاذية وكيفية تكوين هذه الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن تنتج خلايا أورام مغاذية وفيرة لمجموعة متنوعة من التطبيقات بما في ذلك علم الوراثة والسماح بمقايسات وظائف الخلية.

لبدء التجربة ، قم بإذابة كمية من المصفوفة خارج الخلية على الجليد لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. باستخدام أطراف مثلجة باردة ، أنبوب مخروطي بارد سعة 50 مليلتر ووسط Dulbecco المتساوي المعدل ، أو وسط DMEM F12 ، ينقلان ملليغرامين من المصفوفة خارج الخلية إلى 24 مل من DMEM F12 المثلج. انقل الأنبوب المخروطي سعة 50 مل على الفور إلى الثلج وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية.

لتغليف ألواح زراعة الأنسجة ، أضف ملليلتر واحد من المصفوفة خارج الخلية المخففة لكل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار. قم بتدوير اللوحة لتغطية الآبار واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. استنشق المصفوفة خارج الخلية من اللوحة الجديدة وأضف وسط مكيف بالخلايا الليفية الجنينية للفأر أو MEFCM الذي يحتوي على bFGF.

استخدم ماصة لنقل المشابك الخلوية المكشطة من لوحة MEF ونقلها إلى الصفيحة المطلية بالمصفوفة خارج الخلية. ثم احتضن اللوحة. اكشط الخلايا المتمايزة بماصة باستور قبل استبدال MEFCM بوسط bFGF يوميا باستخدام ملليلترين من الوسط لبئر واحد.

عندما تظهر المستعمرات كبيرة ومشرقة تحت المجهر ، تمر hESCs كل ستة إلى سبعة أيام. عندما تكون الخلايا الخالية من المغذيات جاهزة للمرور ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من PBS باستخدام ماصة. قم بشفط PBS واستبدله ب 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر من التباعد الدافئ مسبقا بماصة.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS عن طريق إضافة ملليلترين من PBS لكل بئر وشفط PBS. أضف ملليلترا واحدا من CM لكل بئر واكشط الخلايا يدويا إلى كتل صغيرة باستخدام طرف ماصة سعة خمسة ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بتجميع الخلايا العالقة في ألواح جديدة مطلية بالمصفوفة خارج الخلية. تحضير وسط التمايز. استخدم CM بدون bFGF وأضف مثبطات جديدة قبل الاستخدام.

استخدم hESCs الخالية من المغذيات التي تنمو على ألواح مغلفة بمصفوفة خارج الخلية لممر واحد مزروع داخل حاضنة مجموعة من الأكسجين بنسبة 5٪. بعد الممر الأول على الألواح المطلية بالمصفوفة خارج الخلية ، اترك الخلايا تلتصق لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، ابدأ التمايز عن طريق إزالة CM الذي يحتوي على bFGF واستبداله ب CM يحتوي على BMP4 / A / P بملليلترين لكل بئر في صفيحة من ستة آبار.

استمر في زراعة الخلايا باستخدام مستويات الأكسجين 4٪. استبدل CM الذي يحتوي على BMP4 / A / P كل يومين عن طريق شفط الوسط القديم وإضافة وسيط جديد يحتوي على BMP4 / A / P. اجمع الخلايا في النقاط الزمنية المطلوبة.

استزراع hESCs لمقطعين على مصفوفة خارج الخلية بعد نقلها من MEFs مع وسط hESC يحتوي على bFGF. يعد التقاء الخلايا العالي أمرا مهما ، لذا قم بتقسيم hESCs واحدا لواحد على لوحة جديدة تضمن التقاء بنسبة 50٪ على الأقل في اليوم التالي. احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة الأكسجين المنخفضة.

في اليوم التالي ، استبدل الوسط بملليلترين لكل بئر من وسط التمايز. ضع الخلايا في حاضنة منخفضة الأكسجين طوال الليل. قبل التعداء ، قم بتغطية الجيلاتين طبقا مضيفا 0.1٪ جيلاتين إلى الطبق.

حركي الطبق لتغليف الطبق ، ثم اتركي الطبق في درجة حرارة الغرفة. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة الجيلاتين. ميز الخلايا حتى النقطة الزمنية المطلوبة.

في اليوم السابق للتعداء ، قم بتربسين الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين لمدة خمس دقائق. ضع الخلايا في التقاء المطلوب على اللوحة المطلية بالجيلاتين. أضف CM الذي يحتوي على BMP4 / A / P الذي يفتقر إلى bFGF واحتضان الثقافة بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، أضف وسيط تمايز جديد إلى الخلايا. transfect siRNAs باستخدام كاشف تعداء siRNA. بالنسبة للحمض النووي للبلازما ، استخدم كاشف ليبوفيكتامين مناسب.

اتبع بروتوكول المنتج كما هو موضح لكل كاشف تعداد. انقل مجمعات siRNA lipofectamine إلى كل بئر أو صفيحة من الخلايا واخلطها برفق. ثم قم بزراعة الخلايا طوال الليل في حاضنة منخفضة الأكسجين.

في اليوم التالي ، استبدل الوسائط بوسائط تمييز جديدة. حصاد الخلايا في النقاط الزمنية المطلوبة للتحقق من كفاءة تعطيل الجينات باستخدام RT-PCR الكمي. أخيرا ، لحصاد الخلايا ، أضف ملليلتر واحد من 0.05٪ التربسين لكل بئر واحتضان الخلايا.

أضف خمسة ملليلتر من وسط MEF لكل بئر لتحييد التربسين. قم بتدوير الخلايا عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق واستخدم حبيبات الخلية لعزل الحمض النووي الريبي. باستخدام هذه التقنية ، تظهر التغيرات المورفولوجية بوضوح.

الخلايا في اليوم الأول للتمايز أكبر من الخلايا من اليوم الصفر. مع استمرار التمايز ، تنقسم الخلايا وتتوسع من مركز المستعمرة ، وتنمو في اتجاه خارجي. تندمج المستعمرات الفردية معا عن طريق التمايز في اليوم الخامس مع نمو الخلايا فوق بعضها البعض.

يكشف تحليل QRT-PCR أن مستويات التعبير النسبية لعلامة C متعددة القدرات NANOG تنخفض بنسبة 75٪ بعد يوم واحد من التمايز عندما يتم زراعة الخلايا باستخدام BMP4 وتنخفض بنسبة 90٪ في وجود BMP4 / A / P. بحلول اليوم الثاني من التمايز ، تكون مستويات NANOG منخفضة جدا للخلايا المزروعة في BMP4 وحده أو في BMP4 / A / P مقارنة بتلك الموجودة في وسط hESC CM الذي يحتوي على بيتا FGF. تم إجراء عمليات التعدي باستخدام بلازميد GFP وإدخالها في الخلايا المعالجة ب BMP4 / A / P في اليوم الأول واليوم الثالث على كفاءة تعداء من 30 إلى 50٪ في 24 ساعة بعد التعدين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تمييز الخلايا البشرية متعددة القدرات إلى خلايا الأرومة الغاذية في المختبر وكيفية إدخال تركيبات الحمض النووي لمعالجة التعبير الجيني.