تحليل النسب الخلية ودراسات وظائف الجينات عن طريق التوأم بقعة MARCM
مارس 2, 2017
هنا، نقدم بروتوكول لمعدات وضع العلامات الفسيفساء الذي يسمح التصور من الخلايا العصبية المشتقة من خلية سلفية مشتركة في لونين مميزة. هذا يسهل تحليل النسب العصبية لديها القدرة على الخلايا العصبية الفردية التي يرجع تاريخها ولادة ودراسة وظيفة الجين في نفس الخلايا العصبية من مختلف الأفراد.
الهدف العام لبروتوكول MARCM ثنائي البقعة هو إجراء تحليلات عالية الدقة لنسب الخلايا ودراسات أفضل لوظائف الجينات. تتكون أنسجة المخ من عدد كبير من الخلايا العصبية المتنوعة ، ومن الصعب دراسة الآلية الكامنة وراء كيفية تجمع الخلايا العصبية معا أثناء التطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تسمية الخلايا العصبية المشتقة من أسلاف الخلايا العصبية الشائعة بلونين متميزين.
مما يسمح باسترجاع ولادة معلومات الخلايا العصبية الفردية. لذلك يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين على استكشاف الآلية الخلوية والجزيئية الكامنة وراء التطور العصبي. سيظهر الإجراء اليوم هو Pei-Chi Chung.
فني من مختبر البروفيسور يو. ابدأ بالجمع بين الذكور والإناث الجاهزين من MARCM في قارورة طعام الذباب مع الخميرة الطازجة في القارورة. حافظ على ذباب MARCM ذو النقطتين المتقاطعين جاهزا عند 25 درجة مئوية لمدة يومين لتعزيز فرصة التزاوج قبل جمع البيض المخصب.
لتجنب الاكتظاظ عند فقس اليرقات ، اضغط على ذباب MARCM الجاهز ذو النقطة المزدوجة المتقاطعة ، وانقله إلى قوارير مخميرة طازجة. استزراع نسل MARCM ذو النقطتين ، حتى يصلوا إلى المرحلة المطلوبة من التطور. هنا ، سيتعرض الذباب في مرحلة اليرقات للصدمة الحرارية للحث على تعبير القلب.
انقل قوارير الذبابة إلى حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 و 20 و 30 و 40 و 50 دقيقة لتحديد الصدمة الحرارية المثلى للتعبير عن التقليب. لإنشاء استنساخ MARCM ذات النقطة المزدوجة ذات الأهمية. يحدد توقيت الصدمة الحرارية مرحلة توليد المقاصة ، بينما تحدد فترة الصدمة الحرارية عدد عمليات المقاصة التي سيتم إنشاؤها.
صدمت زراعة الحرارة MARCM ذات النقطتين عند 25 درجة مئوية ، حتى مرحلة النمو المرغوبة. ثم انتقل إلى تلطيخ وتركيب. أضف PBS إلى أطباق حماية الملقط.
وبعد ذلك ، انقل MARCM ذات المكانة المزدوجة إلى الأطباق. أثناء النظر من خلال مجهر التشريح ، استخدم الملقط لتشريح أدمغة MARCM ذات النقطتين المزدوجتين. أولا ، قم بإزالة الرأس من جسم الذبابة.
ثم قم بإزالة البشرة برفق دون الإضرار بالدماغ. بعد ذلك ، قم بإزالة القصبة الهوائية بعناية التي تظهر على شكل ألياف بيضاء اللون. نقل الأدمغة إلى صفيحة موضعية زجاجية تحتوي على 4٪ فورمالديهايد و PBS.
وإصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ابدأ إجراء التلوين عن طريق شطف دماغ الذباب ثلاث مرات باستخدام 1٪ PBT. ثم يغسل مع 1٪ PBT ثلاث مرات.
مع رج لمدة 30 دقيقة في كل مرة. احتضان أدمغة الذباب بمزيج من الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند أربع درجات مئوية أو لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. اشطف واغسل دماغ الذباب ثلاث مرات لكل منها بنسبة 1٪ PBT ، مع رج كما كان من قبل.
ثم احتضان أدمغة الذباب بمزيج من الأجسام المضادة الثانوية لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد شطف الأدمغة وغسلها كما كان من قبل ، قم بتركيب الأدمغة على شريحة صغيرة باستخدام كاشف مضاد للتبريد. ثم ضع غطاء زجاجي لتغطية وحماية أدمغة الذباب.
أغلق حواف زجاج الغطاء الصغير والشريحة الدقيقة باستخدام طلاء الأظافر الشفاف. أخيرا ، التقط صورا فلورية لاستنساخ MARCM مزدوجة البقع من العينات باستخدام نظام الفحص المجهري متحد البؤر المفضل. يوضح هذا الشكل نتائج استنساخ MARCM المزدوج النقطة، وهو عبارة عن خلايا عصبية إسقاط شمية ظهرية متقدمة VL2p مشتقة من تحريض الفليبباز.
للتوسط في إعادة التركيب الفطري في الانفجار العصبي adPN في المرحلة الجنينية. يوضح هذا الرسم البياني الأول نمط تكوين الخلايا العصبية. في صورة المجهر متحد البؤر هذه للدماغ ، تظهر VL2p adPNs باللون الأخضر وترتبط ب adPNs للانفجار العصبي متعدد الخلايا في الأرجواني.
تظهر هذه الصورة الخلايا الموجودة في القرن الجانبي. يظهر التشكل العصبي للفص الهوائي. تعرض هذه الصورة بيانات DL1 adPNs.
كما هو موضح هنا ، تظهر DL1 adPNs في وقت لاحق من VL2p adPNs. يوضح تحريض استنساخ MARCM المزدوج البقعة من DC3 adPNs أن هذا النوع العصبي يظهر في وقت لاحق من التطور. توضح هذه الصورة أن حدث MARCM مزدوج النقطة يحدث في خلية عصبية سالبة GAL4 داخل سلالة adPN.
بمجرد إتقانها ، يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين على تحليل النسب العصبي وتوفير علامات مختلفة لتمييز الخلايا العصبية عن استنساخ الخلايا العصبية. علاوة على ذلك ، يمكن أن ينتج MARCM ثنائي البقع استنساخا متاثلة الزيجوت لاستكشاف الآلية الجزيئية. في خلفية وراثية متغايرة الزيجوت.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكول MARCM ذو البقع المزدوجة (twin-spot) المصمم لتحليلات سلالة الخلايا عالية الدقة ودراسات وظائف الجينات في الخلايا العصبية. ومن خلال وسم الخلايا العصبية المنحدرة من خلايا سلفية مشتركة بلونين متميزين، يمكن للباحثين تتبع تطور وتحديد تاريخ ميلاد الخلايا العصبية الفردية بفعالية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا التنموية
خلفية علمية
- تتكون أنسجة الدماغ من مجموعة متنوعة من العصبونات.
- تعد عملية فهم تجميع العصبونات أثناء التطور عملية معقدة.
- قد لا توفر التقنيات الحالية دقة كافية لتتبع السلالة الخلوية.
- يهدف هذا البروتوكول إلى معالجة هذه التحديات.
الغرض من الدراسة
- لإجراء تحليلات تفصيلية لسلالات الخلايا.
- لتعزيز الدراسات المتعلقة بوظيفة الجينات في الخلايا العصبية.
- لتسهيل استكشاف الآليات الخلوية والجزيئية في التطور العصبي.
الطرق المستخدمة
- بروتوكول MARCM ثنائي البقع لوسم العصبونات.
- استخدام علامات لونية متميزة لتتبع السلالة.
- تقنيات التصوير عالية الدقة.
- تحليل التطور العصبي ووظيفة الجينات.
النتائج الرئيسية
- نجاح وسم الخلايا العصبية المشتقة من أسلاف مشتركة.
- القدرة على استرجاع معلومات تاريخ ميلاد الخلايا العصبية الفردية.
- تعزيز فهم السلالة العصبية والنمو العصبي.
- التطبيقات المحتملة في دراسة وظائف الجينات في أفراد مختلفين.
الاستنتاجات
- يُعد بروتوكول MARCM ذو البقع التوأمية أداة قيمة في أبحاث العلوم العصبية.
- فهو يسمح بإجراء تحليل مفصل لسلالة الخلايا العصبية ووظيفة الجينات.
- ويمكن لهذه التقنية أن تساهم بشكل كبير في تعزيز فهمنا للتطور العصبي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في المجال الصناعي
يوفر فهم السلالة العصبية ووظيفة الجينات في الكائنات النموذجية رؤى أساسية للتحقق من الأهداف في تطوير العلاجات العصبية. وتتيح تقنية twin-spot MARCM رسم خرائط عالية الدقة لترتيب ولادة العصبونات والتحليل المظهري للعصبونات المتطابقة جينياً عبر الأفراد، مما يدعم الحد من المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية من خلال ربط الآليات التنموية بالنتائج الوظيفية في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال تتبع السلالة العصبية من أسلاف مشتركة لتقييم وظيفة الجينات في مجموعات خلوية محددة.
- القيمة التشغيلية: يسهل تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحليل المظهري للمستنسخات الطفرية متماثلة الزيجوت في خلفيات متباينة الزيجوت، مما يقلل من الغموض الميكانيكي.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز محفظة المشاريع من خلال توفير بيانات كمية عن السلالات ترتبط بآليات الأمراض العصبية التنموية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: إنتاج أنظمة عصبونية مصنفة بالألوان ومحققة، تكون مناسبة لعمليات فحص المركبات اللاحقة في الدوائر العصبية ذات الصلة بالأمراض.
- القيمة التشغيلية: ضمان توحيد المقايسة وقابلية تكرارها من خلال توليد نسائل محفزة وخاصة بمرحلة معينة يتم التحكم بها عن طريق مدة الصدمة الحرارية.
- القابلية للتوسع: تمكين إعادة استخدام المنصة عبر أنواع فرعية عصبونية متعددة (على سبيل المثال، سلالات adPN) لإجراء فحص مظهري مقارن.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: يدعم نمذجة الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال تمكين تحليل ترتيب ولادة الخلايا العصبية المتورطة في الاضطرابات النمائية العصبية.
- تقليل مخاطر الآلية: يتيح التحليل المظهري للخلايا العصبية المتطابقة عبر الحيوانات للتمييز بين التباين الجيني والتباين العشوائي في دراسات وظائف الجينات.
- الاستمرارية قبل السريرية: يربط بين مرحلتي الاكتشاف والتحقق من خلال توفير بيانات دقيقة للسلالات لدراسات ارتباط الأهداف وتعديل المسارات.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل طريقة MARCM ذات البقعة المزدوجة ضمن تسلسل الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى الدراسات الميكانيكية قبل السريرية، ولا سيما في المؤشرات الخاصة بالتطور العصبي حيث يكون الأصل العصبي والترابط العصبي أمرين حاسمين.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال ربط الاضطراب الجيني بالأنماط الظاهرية العصبونية المحددة للسلالة.
- المسح: توفر تحضيرات عصبونية قابلة للتكرار وجاهزة للمقايسة مع مخرجات كمية تعتمد على توقيت الولادة النسيلية والتعبير عن المؤشرات.
- التحليلات: تتيح التحليل المقارن للمورفولوجيا العصبونية والتعبير الجيني عبر المراحل النمائية باستخدام قراءات ثنائية اللون.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالتحقق قبل السريري من خلال توفير نماذج محاذية للسلالة لتعديل الأهداف المحاذية للمؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة قابلة لإعادة الاستخدام لتوليد مجموعات عصبونية معيارية عبر المشاريع وأنظمة النماذج المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل العوامل المربكة المرتبطة بالسلالة في دراسات وظائف الجينات.
- القيمة التشغيلية: تحسين قابلية التكرار والتوحيد القياسي من خلال الحث النسيلي المنضبط وبروتوكولات الصبغ والتثبيت الموحدة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق تمكين الكشف المبكر عن التأثيرات المظهرية الخاصة بالسلالة، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: دعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال توفير وضوح ميكانيكي للأهداف العصبية في الأنسجة غير المتجانسة.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في علم وراثة Drosophila، وتقنيات الوسم النسيلي (clonal labeling)، والمجهر البؤري (confocal microscopy) لتفسير السلالات بدقة.
- تعتمد على الأجهزة والمعدات بما في ذلك جهاز الصدمة الحرارية، ومجاهر التشريح، وأنظمة التصوير البؤري من أجل تحفيز النسائل وتصورها.
- تستلزم توحيداً قياسياً بين الفرق فيما يتعلق بتوقيت الصدمة الحرارية، وبروتوكولات الصبغ، ومعايير التصوير لضمان اتساق النسائل بين المستخدمين.
- تتضمن اعتبارات التكيف عند تطبيق الطريقة على سلالات عصبية مختلفة أو مراحل نمو أخرى تتجاوز نموذج adPN الموضح.
- تتضمن قيوداً عملية مثل اعتماد كفاءة النسيلة على مدة الصدمة الحرارية والحاجة إلى التحسين وفقاً للسلالة المستهدفة، كما هو مذكور في البروتوكول.
