إعداد العملاق الحويصلات تغليف المجهرية بواسطة الطرد المركزي من مستحلب الماء في الزيت

الهدف العام من طريقة الطرد المركزي المستحلب بالماء في الزيت هو تحضير حويصلة عملاقة ذات طبقة رقيقة بسهولة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التركيبية مثل إنشاء خلية اصطناعية تعتمد على حويصلة عملاقة. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول مخزون 25 مليمولار من DOPC ومحلول مخزون من نقطة صفر اثنين من Texas Red DHPE في الكلوروفورم.

بعد ذلك ، قم بتشكيل طبقة دهنية على السطح الداخلي لقارورة زجاجية سعة خمسة ملليلتر عن طريق تبخير خليط من محاليل مخزون DOPC و Texas Red DHPE تحت غاز النيتروجين المتدفق. بعد احتضان الفيلم تحت ضغط منخفض طوال الليل ، أضف ملليلتر واحد من البارافين السائل إلى القارورة. لف القارورة بورق الألمنيوم واحتضن الخليط على حرارة 80 درجة مئوية طوال الليل.

في نقطة واحدة خمسة ملليلتر ، امزج الأنابيب الدقيقة ذات الغطاء 237 نقطة وخمسة ميكرولترات من ميكرومتر واحد من الكريات المجهرية غير الفلورية و 12 نقطة خمسة ميكرولترات من الكريات المجهرية الفلورية الدقيقة الدقيقة ميكرومتر واحد. أضف الآن 64 ملليغراما من السكروز متبوعا ب 125 ميكرولترا من محلول تريس المخزن و 875 ميكرولترا من الماء منزوع الأيونات إلى الأنبوب الدقيق. دوامة الخليط لمدة 30 ثانية ، ثم صوتنة لمدة 10 دقائق.

بعد تحضير 10 ملليلتر من محلول تريس المخزن ، ضع مليلتر واحد في أنبوب دقيق بغطاء بسعة خمسة ملليلتر. بمجرد أن يتم دوامة المحلول وصوتنة ، امزج ملليلتر واحد من محلول الزيت مع 300 ميكرولتر من المحلول المائي الداخلي في أنبوب دقيق بسعة خمسة ملليلتر. قم باستحلاب المكونين في الأنبوب الدقيق باستخدام مجانس ميكانيكي يعمل عند 10 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، ضع طبقة برفق 300 ميكرولتر من مستحلب الماء في الزيت على السطح العلوي لمليلتر واحد من المحلول المائي الخارجي عند أربع درجات مئوية في أنبوب دقيق بغطاء بزاوية واحدة وخمسة ملليلتر. مباشرة بعد تبريد الأنبوب الدقيق لمدة 10 دقائق ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 18 ، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة. عند الانتهاء ، احصل على الحويصلات العملاقة المترسبة أو GVs عن طريق ثقب الجزء السفلي من الأنبوب الدقيق بدبوس دفع وجمع قطرة واحدة في أنبوب دقيق معقم بزاوية واحدة وخمسة ملليلتر.

ضع غرفة حضانة لاصقة لتفاعل البوليميراز المتسلسل NC والتهجين فوق زجاج غطاء المجهر. باستخدام ماصة دقيقة ، قم بإيداع 25 ميكرولترا من المركبات العالمية المترسبة المخففة على منطقة العينة ووضع على الفور نقطة صفر بسمك خمسة ملليمترات غطاء زجاجي أعلى غرفة الحضانة. بعد تسجيل صور الفحص المجهري للحويصلات ، قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري عن طريق إدخال وحدات المرآة الفلورية UFBNA و UFMCHE أولا في المجهر.

ثم قم بتركيب الوحدات بمرشحات الإثارة ومرشحات الانبعاث للتحليل. أهم محدد لنجاح طريقة الماء في الزيت هو أن الثقل النوعي للمحلول المائي الداخلي يجب أن تكون أكبر من الثقل النوعي للمحلول المائي الخارجي بحيث تترسب المركبات العالمية أثناء الطرد المركزي. أكد الفحص المجهري للتداخل التفاضلي والفحص المجهري الفلوري للمركبات العالمية بدون كريات مجهرية ومع الكريات المجهرية أن المركبات العالمية ذات الصفائح المنخفضة قد تشكلت.

من بين 160 GVs التي تم الحصول عليها ، كان 55 كرية مجهرية مغلفة و 105 فارغة مما يعطي نسبة 34٪ من التغليف. قدر الجزء الحجمي من المجهريات في المركبات العالمية بحوالي 11 زائد أو ناقص ثلاثة بالمائة من الحجم وكانت دقة الكسر الحجمي المحسوب من 10 إلى 30٪ تغليف المواد الأخرى في 100 مول بالمائة DOPC GVs باستخدام نفس المحلول المائي الخارجي وكان نفس البروتوكول ناجحا كما هو موضح في الفحص المجهري للتداخل التفاضلي والفحص المجهري الفلوري. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل توضيح الخلية النموذجية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الحويصلات العملاقة بمواد مغلفة.