قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التفاعلية الخيفية للخلايا التائية باستخدام قياس التدفق الخلوي التصويري. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مناعة الزرع، مثل تحديد نسبة الخلايا التائية لدى المتلقي التي تتفاعل مع المستضدات الخيفية للمانح. وتجمع هذه التقنية بين القدرات الكمية متعددة المعايير لقياس التدفق الخلوي وقدرات التصوير بالمجهر الفلوري، مما يسمح بفحص عالي الإنتاجية للمشابك الفردية بين الخلايا التائية والخلايا المقدمة للمستضد.

سيقوم سجاد مشكل گشا، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ بزراعة 0.5 × 10⁶ من الخلايا التغصنية في كل بئر من أطباق زراعة الخلايا ذات الـ 96 بئراً، تليها 1 × 10⁶ من الخلايا التائية، مع استكمال الحجم النهائي بوسط زراعة ليصل إلى 50 µL إجمالاً لكل بئر.

تُحضن المزارع الباردة لمدة أربع ساعات عند 37 °C و 5% CO2. بعد ذلك، يُضاف إلى كل بئر من مزارع الخلايا كمية من الفورمالدهيد بتركيز 1.5% في PBS تعادل ثلاثة أضعاف حجم المزرعة، ويُترك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية عملية التثبيت، تُنقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 mL مطابق.

قم بصبغ الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المقترنة بالفلوروكروم المناسب في 100 µL من محلول غسيل منظم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. بعد ذلك، اغسل الخلايا في 1 mL من محلول غسيل منظم وأعد تعليق الرواسب في محلول نفاذية/غسيل منظم يحتوي على phalloidin FITC. بعد مرور 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء، اغسل الخلايا في 1 mL من محلول نفاذية/غسيل منظم جديد.

أعد تعليق الرواسب في صبغة النواة المطلوبة في محلول النفاذية/الغسيل (perm/wash buffer) لفترة حضانة نهائية مدتها 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. اغسل الخلايا في 1 mL من محلول النفاذية/الغسيل، يليه غسلة واحدة في محلول الغسيل وحده. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 50 إلى 100 µL من محلول غسيل جديد.

انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة صغيرة ذات أغطية. ولتحليل التفاعلات بين الخلايا، خصص قناة واحدة أولاً للحصول على صور المجال المضيء (brightfield) وقم بتحميل أنبوب التحكم الأول. ومع إيقاف تشغيل قناة المجال المضيء، أنشئ في نافذة مساحة العمل مخطط تشتت جديد لكل قناة مستخدمة بحيث تكون نسبة العرض إلى الارتفاع مقابل المساحة.

قم بتحديد البوابة (Ingate) للخلايا المفردة (singlets) التي تكون نسبة العرض إلى الارتفاع (aspect ratio) فيها قريبة من الواحد. لكل فلوروكروم، تحقق من المجموعة الإيجابية واضبط جهد الليزر في صندوق الإضاءة حسب الضرورة. في صندوق القنوات، اختر القنوات المناسبة للفلوروكرومات المستخدمة في الصبغ.

بعد ذلك، انقر فوق تسجيل. عندما يصل عدد الأحداث إلى العتبة المحددة، سيتوقف الاستحواذ تلقائياً. وبعد الانتهاء من استحواذ جميع ضوابط الصبغة الواحدة، قم بتحميل أنبوب العينة التجريبية الأولى واستحوذ عشرات الآلاف من الأحداث تحت قنوات التحليل المناسبة، بما في ذلك قناة المجال المضيء.

لإنشاء مصفوفة تعويض، قم بتحميل ملفات بيانات ضوابط الصبغ المنفرد في معالج التعويض واختيار القنوات الفلورية المناسبة للتجربة. بعد التأكد من اختيار المجموعات الإيجابية الصحيحة، انقر نقراً مزدوجاً على قيمة في المصفوفة وأضف الرسم البياني إلى منطقة التحليل لكل قناة. انقر على "إنهاء" لحفظ مصفوفة التعويض كملف CTM.

قم بتحميل ملف RIF في برنامج التحليل المناسب. قم بتحويل ملف RIF إلى ملف DAF المخصص لتحليل البيانات. افتح ملف العينة الأول.

قم برسم الجذر التربيعي لمتوسط مربع معدل تغير شدة التصوير في قناة المجال المضيء. ثم، قم برسم النسبة الباعية مقابل المساحة لعلامة الخلية المقدمة للمستضد. قم بتحديد الخلايا المزدوجة التي تحتوي على خلية مقدمة للمستضد واحدة.

قم برسم النسبة الباعية مقابل المساحة لوسم الخلايا التائية (T cell). قم بعمل بوابة (Gate) على الثنائيات التي تحتوي على خلية تائية واحدة. ولتحديد الخلايا المتصلة ببعضها البعض، استخدم خيار الأقنعة (masks) من قائمة التحليل لفتح مدير الأقنعة، وقم بتسمية القناع الجديد "قناع كائن الخلايا التائية" (T cell object mask).

انقر فوق زر الوظيفة (function)، ومن مربع الحوار، اختر "كائن" (object). حدد القناة التي يتم فيها الكشف عن علامة الخلية التائية (T cell marker) ثم انقر فوق موافق (OK). قم بإنشاء قناع لعلامة الخلية المقدمة للمستضد (antigen-presenting cell marker) في القناة المناسبة بنفس الطريقة. ارسم شدة فلورة علامة الخلية التائية في قناع كائن الخلية المقدمة للمستضد مقابل شدة فلورة الخلية المقدمة للمستضد في قناع كائن الخلية التائية.

بعد ذلك، قم برسم بوابة تشمل فقط الخلايا المتلامسة مع بعضها البعض. وأخيراً، قم بمراجعة صور phalloidin FITC للأحداث الموجودة ضمن هذه البوابة يدوياً للتمييز بين المشابك المناعية الناضجة والتلامسات الخلوية البسيطة، وذلك باستخدام وظيفة صور العلامات (tag images) لتمييز هذه الصور. يظهر هنا بوابة تلامس الغشاء لخلايا T الموجبة لـ CD4 الطحالية التي تم الحصول عليها من مستقبلين متسامحين وغير متسامحين لـ B6 cardiac allografts بعد سبعة أيام من الزرع وتم تحضينها مع خلايا dendritic cells مشتقة من نخاع العظم لـ B6، كما هو موضح.

مع الإشارة إلى الأحداث التشابكية وغير التشابكية بواسطة علامات التقاطع الخضراء. كما تسمح تحليلات القنوات المضيئة والمجال الساطع بتصور الأحداث التشابكية وغير التشابكية الفردية. وبالفعل، يمكن تمييز التشابكات من مستلمي قلوب B6 من نوع CDA، سواء غير المتحملين أو المتحملين، بسهولة عن الاتصالات غير التشابكية من خلال وجود حواف كثيفة موجبة لـ FITC عند الواجهة بين الخلية التائية والخلية المقدمة للمستضد.

بعد مزيد من التطوير، قد يكون من الممكن تطبيق هذه التقنية في الإعدادات السريرية، مثل تقليل أو سحب الأدوية المثبطة للمناعة، أو التنبؤ بنتائج الطعم لدى متلقي عمليات الزرع من البشر.