العزلة وإثراء الكبد السلف مجموعات فرعية تم تحديدها من قبل رواية السطح علامة الجمع

تتمثل الأهداف العامة لبروتوكول هضم الكبد هذا في تقييم المجموعات الفرعية المختلفة من سلائف الكبد عن طريق قياس التدفق الخلوي، وعزل هذه الخلايا بنقاوة عالية باستخدام خليط من علامات السطح المبتكرة لإجراء المزيد من التحليلات اللاحقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات متنوعة حول بيولوجيا خلايا سلائف الكبد، على سبيل المثال، ما هي السمات الخاصة بكل مجموعة فرعية وما هي مسبباتها البعيدة أثناء إصابة الكبد. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بعزل الخلايا السلفية بنقاوة وحيوية عاليتين، وهو أمر بالغ الأهمية للتحليل في المختبر.

على الرغم من أن تقنية الهضم هذه توفر رؤى حول بيولوجيا الخلايا السلفية، إلا أنه يمكن استخدامها بالفعل لعزل مجموعات الخلايا المكونة للدم والخلايا البطانية. لتحضير مستنبت خلوي أحادي من كبد فأر، انقل الفصوص إلى أطباق بتري جافة واستخدم مشرطاً لتقطيع الأنسجة إلى مكعبات متجانسة يبلغ حجمها حوالي 2 millimeters cubed. انقل القطع إلى أنبوبي طرد مركزي مخروطي سعة 15 milliliter لكل كبد، بحيث يحتوي كل أنبوب على 2.5 milliliters من محلول الهضم المنظم.

وضع العينات في حمام مائي عند درجة حرارة 37 degrees Celsius مع الرج الخفيف لمدة خمس و10 دقائق. وبعد 15 دقيقة من الهضم، استخدم ماصة سعة 1,000 microliter ذات طرف مقطوع لترقيب قطع الكبد بلطف. ثم أعد الأنابيب إلى الحمام المائي واترك القطع تترسب لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، قم بترشيح عليتين من السائل الطافي بحجم 700 µL تقريباً عبر مصفاة بمسامية 100 micron مبللة مسبقاً بـ 800 µL من منظم التجميع (collection buffer). واستبدل السائل الطافي الذي تمت إزالته بمنظم هضم (digestion buffer) جديد. وعندما لا يعود نسيج الكبد مرئياً، قم بتمرير كل السائل الطافي من أنابيب الهضم عبر المرشح.

ثم اجمع كافة الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الراسب في 1 mL من منظم تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم في درجة حرارة الغرفة، مع إيقاف عملية التحلل بإضافة 5 mL من منظم التجميع الطازج بعد مرور دقيقة واحدة. اجمع الخلايا بإجراء عملية طرد مركزي أخرى.

بعد ذلك، اسحب السائل الطافي بعناية دون تعكير الراسب الرخو. ثم أعد تعليق الخلايا في 4 mL من محلول تجميع حديث على الثلج. ولتحديد عدد خلايا عينة الكبد عن طريق قياس التدفق الخلوي، اخلط أولاً 20 µL من معلق خلايا الكبد مع 174 µL من PBS في أنبوب بوليسترين سعة 1.5 mL و 6 µL من propidium iodine.

أضف حبيبات العد التي تسمح بتحديد كمية الخلايا، ثم قم بتحميل خليط الحبيبات والخلايا على جهاز قياس التدفق الخلوي. قم بتحديد البوابة (Gate) على تشتت الجانب (side scatter) بناءً على معايير التشتت الأمامي (forward-scatter) لتجنب الشوائب. استبعد الخلايا المزدوجة (doublets) عبر بوابة ارتفاع التشتت الأمامي مقابل مساحة التشتت الأمامي، وكذلك الخلايا الميتة الموجبة لصبغة propidium iodine.

ثم، قم بتحميل عينة بحجم 30 µL على جهاز قياس التدفق الخلوي وسجّل الأحداث. ولصبغ خلايا الكبد من أجل تحليل المجموعات الفرعية للخلايا السلفية باستخدام قياس التدفق الخلوي، انقل حصصاً مكونة من 2x10^5 من الخلايا إلى أنابيب تفاعل بحجم 1.5 mL. وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الراسب في Fc block لمدة خمس دقائق من الحضانة على الثلج. ثم أضف 50 µL من كوكتيل أجسام مضادة خاصة بصبغ سطح الخلية المطلوبة إلى الأنابيب المناسبة، مع الحضانة لمدة 20 دقيقة على الثلج في مكان محمي من الضوء. وفي نهاية فترة الحضانة، اغسل العينات باستخدام 400 µL من محلول صبغ لكل عينة.

ثم أعد تعليق الرواسب في 100 µL من خليط الأجسام المضادة الثانوية المناسب لمدة 20 دقيقة على الثلج مع الحماية من الضوء. بعد ذلك، اغسل الخلايا بـ 400 µL أخرى من محلول التلوين المنظم. ثم أعد تعليق الرواسب في 300 µL من محلول التلوين المنظم الذي يحتوي على propidium iodide.

قم بقياس العينة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer). ولإثراء مجتمع الخلايا السلفية عن طريق الفصل المعتمد على الخرزات المغناطيسية الدقيقة، انقل 1.5-2x10^6 خلية إلى العدد المناسب من أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الرواسب في 400 µL من محلول HBSS المضاف إليه BSA.

ثم أضف 40 µL من خرزات anti-CD31 الدقيقة و 30 µL من خرزات anti-CD45 الدقيقة مع الحضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، اغسل الخلايا في 5 mL من محلول HBSS مضافاً إليه BSA. ثم أعد تعليق الرواسب في 100 µL من خرزات إزالة الخلايا الميتة مع الحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بينما تخضع الخلايا للتحضين، يتم موازنة عمود اختيار إيجابي واحد بحجم مناسب لكل كبد باستخدام 3 mL من HBSS مع BSA. بعد ذلك، يتم إضافة 900 µL من HBSS مع BSA إلى الخلايا وترشيح الخلايا عبر شبكة ترشيح من البولي أميد بمقاس 100 micron. يتم تحميل الخلايا المرشحة والمحضنة مع الخرزات على الأعمدة مع تجميع الرشاحة في أنبوب الطرد المركزي.

عندما تتدفق جميع الخلايا عبر العمود، اغسل الأعمدة ثلاث مرات باستخدام ثلاثة ملليلتر من HBSS المضاف إليه BSA. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليق الراسب الخلوي في 100 ميكروليتر من محلول الشطف وFc block. اسحب الرواسب الخلوية من أربعة إلى ستة أكباد أو ما يصل إلى أقل من 1x10^6 من الخلايا المختارة سلبيًا.

بعد مرور خمس دقائق، يتم وسم الخلايا باستخدام الجسم المضاد anti-GP38 الموغل بالبيوتين لمدة 10 دقائق على الثلج. وفي نهاية فترة التحضين، تُجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لإعادة تعليقها في 400 microliters من محلول الشطف وخمس microliters من Anti-Biotin Microbeads. وبعد 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius، تُغسل الخلايا فوراً في خمس milliliters من محلول الشطف.

ثم أعد تعليق الراسب في 1 مل من محلول غسيل جديد. ضع الخلايا المعاد تعليقها على حامل 15 مبرّد وابدأ الفصل المغناطيسي التلقائي. بعد ذلك، قم بطرد السائل المار مركزياً وأعد تعليق الرواسب في المحلول المناسب للتحليل التجريبي اللاحق المخطط له.

يؤدي تحديد البوابات (Gating) للخلايا السلبية لـ CD45 وCD31 ومستقبل البروتين السكري غير المرتبط بالسيالوز واحد (asialoglycoprotein one receptor) إلى اختيار الخلايا السلفية الكبدية، والتي يمكن تجميعها بعد ذلك وفقاً لتعبيرها عن glycoprotein 38 وCD133. تمثل الخلايا الإيجابية لـ gp38 والإيجابية لـ CD133، والخلايا السلبية لـ gp38 والإيجابية لـ CD133، المجموعات الخلوية الأكثر وفرة بين الخلايا السلبية لـ CD45 وCD31 وASGPR1 في كبد الفأر البالغ السليم، مع وجود اختلافات واضحة في تعبيرها عن مختلف العلامات السطحية المرتبطة سابقاً بالخلايا السلفية. ويؤدي عزل هذه الخلايا السلفية القائم على الخرزات المغناطيسية الدقيقة، كما تم توضيحه للتو، إلى الحصول على خلايا كبدية بنقاوة تتجاوز 90% مع درجة عالية من الحيوية.

عند محاولة عزل هذه الخلايا غير الشائعة، من المهم مراعاة الإنزيمات المستخدمة خلال خطوات هضم الكبد، حيث يمكن أن تؤدي الإنزيمات المختلفة تفضيلياً إلى الحصول على مجموعات فرعية محددة من الخلايا السلفية، وقد تقلل بشكل كبير من مستويات تعبير CD133. ومن المهم تذكر أن نقاء الخلايا ومردودها يعتمدان على التحضير اللطيف لمعلقات الخلايا المفردة من الكبد، وأن الكمية العالية من الحطام الخلوي والتلوث بالخلايا الميتة يمكن أن تؤثر سلباً على نجاح هذا البروتوكول.