ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء جهاز موائع دقيقة متعدد ميثيل سيلوكسان - بولي كربونات لهجرة خلايا الثدييات تحت مجموعات مختلفة من التدرجات الكيميائية العمودية والأكسجين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسات هجرة خلايا الثدييات بما في ذلك تأثيرات هذه التدرجات على هجرة أنواع مختلفة من الخلايا أو الخلايا ذات الجينات ote. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء الإعداد التجريبي بالكامل في حاضنة تقليدية لظروف زراعة الخلايا المثلى دون إعداد ممل وأجهزة ضخمة.

امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص قدرة ورم خبيث للخلايا السرطانية حيث يمكن توصيف حركة الخلية والتدرجات المختلفة ذات الصلة بالفسيولوجيا باستخدام جهاز الموائع الدقيقة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول هجرة خلايا الثدييات. يمكن أيضا تطبيقه على دراسات الخلايا الأخرى مثل اختبار الأدوية القائم على الخلايا المختبرية على مجموعات تركيزات الدواء وتوترات الأكسجين.

انقل جرامين من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان ، أو البوليمر المسبق PDMS إلى القالب باستخدام أنماط القناة السائلة ذات الطبقة العليا لعمل طبقة رقيقة من PDMS. بعد ذلك ، ضع القالب في إعداد مجفف لتفريغ PDMS لمدة 60 دقيقة. بعد التفريغ ، ضع القالب طوال الليل في فرن 60 درجة مئوية لمعالجة PDMS.

تأكد من أن القالب في مستوى أفقي. بعد تبريد القالب إلى درجة حرارة الغرفة ، اسكب 13 جراما إضافيا من البوليمر المسبق PDMS على القالب ، ثم قم بإزالة PDMS في إعداد المجفف لمدة 60 دقيقة. قم بتضمين مادة البولي كربونات بسمك ملليمتر واحد ببطء ، أو فيلم الكمبيوتر الشخصي في طبقة PDMS الجديدة كحاجز لانتشار الغاز.

طرد أي فقاعات موجودة. ثم ضع القالب في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل. تأكد من أن القالب على مستوى أفقي.

بعد تبريد PDMS المعالج إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بقص الجهاز بمشرط إلى مساحة 5.5 × خمسة سنتيمترات مربعة تقريبا والتي يمكن أن تغطي جميع أنماط القنوات. ثم قم بإزالة مختبر PDMS من القالب. بعد ذلك ، قم بعمل ثقوب للمداخل والمخارج باستخدام لكمة خزعة قطرها ملليمترين.

قم بتخزين طبقة PDMS-PC العلوية المصنعة بعيدا عن الغبار المحيط لتجميعها لاحقا. لتجميع الجهاز ، ضع أولا الطبقة العليا PDMS-PC المصنعة والرقاقة مع غشاء PDMS المشفر بالدوران في آلة معالجة سطحية بالأكسجين والبلازما مع توجيه أسطح الترابط لأعلى. عالج أسطح PDMS ب 90 واط من بلازما الأكسجين لمدة 40 ثانية.

اربط الطبقة العليا بغشاء PDMS مباشرة بعد المعالجة السطحية لبلازما الأكسجين. ضع وزنا على الجزء العلوي من الطبقات المترابطة وضعها في فرن 60 درجة مئوية طوال الليل لتعزيز الترابط. بمجرد أن تبرد الطبقات المستعبدة إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بقطع الغشاء المرتبط بالطبقة العليا بمشرط إلى مساحة 5.5 × خمسة سنتيمترات مربعة تقريبا.

قم بتقطيع الهيكل المستعبدين من رقاقة السيليكون وقم بعمل ثقوب عند مداخل ومخارج قناة التدرج الكيميائي باستخدام لكمة خزعة قطرها ملليمترين. بعد ذلك ، ضع الطبقة العليا المرتبطة بالغشاء والطبقة السفلية PDMS المصنعة في آلة المعالجة السطحية لبلازما الأكسجين مع مواجهة أسطح الترابط لأعلى. لتنشيط أسطح PDMS، استخدم البلازما بقدرة 90 واط لمدة 40 ثانية.

قم بتوصيل الطبقات العلوية والسفلية معا للترابط مباشرة بعد المعالجة السطحية. ضع الوزن فوق الجهاز المرتبط بالكامل واتركه طوال الليل في فرن 60 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أخرج الجهاز المصنع بالكامل من الفرن وقم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة.

ابدأ مقايسة هجرة الخلايا الموائع الدقيقة عن طريق تحضير الخلايا الموجودة في الجهاز كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الثاني ، استنشق الوسط من الخلايا التي تمت زراعتها منذ اليوم صفر واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من DPBS مرتين. استنشق DPBS وأضف ملليلترين من Trypsin-EDTA ، ثم احتضن الخلايا في الحاضنة لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا عن سطح القارورة.

بمجرد فصل الخلايا وتعليقها في المحلول ، أضف ثمانية ملليلتر من الوسط الخالي من المصل إلى القارورة. انقل جميع السوائل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بطردها بمعدل 140 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وأضف كمية مناسبة من الوسط الخالي من المصل لكثافة خلية نهائية تبلغ مليون خلية لكل مليلتر.

بعد ذلك ، أخرج جهاز الموائع الدقيقة الذي تم إعداده في اليوم الأول كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة غير حادة عيار 14 لحقن الوسط الخالي من المصل من خلال مخرج قناة التدرج الكيميائي حتى يتدفق الوسط من كلا الإبرتين عند المداخل. ثم قم بحقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية من مخرج قناة التدرج الكيميائي.

راقب غرفة زراعة الخلايا في الجهاز تحت المجهر للتأكد من إدخال الخلايا إلى قناة الموائع الدقيقة. بعد ذلك ، ضع الجهاز في وعاء رطب واحتفظ به في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمس ساعات لتعزيز التصاق الخلايا بسطح الجهاز. في هذه الأثناء ، قم بإعداد المادة الكيميائية بالتركيز المطلوب في وسط خال من المصل.

ارسم الوسط الخالي من المصل مع المادة الكيميائية وبدونه في حقنتين منفصلتين سعة ثلاثة ملليلتر متصلتين بالأنبوب عالي النقاء. بعد ذلك ، قم بإعداد المحاقن على مضخة حقنة بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الدقيقة لاستخدامها لاحقا. بعد ذلك ، اصنع 15 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم أحادي المولار و 15 مل من 200 ملليغرام لكل مليلتر من محلول بيروجالول.

اسحب محلول هيدروكسيد الصوديوم في حقنة سعة 15 مليلتر متصلة بأنبوب PFTE عالي النقاء واسحب محلول البيروغالول إلى حقنة سعة 15 ملليلتر متصلة بأنبوب عالي النقاء. قم بإعداد المحاقن على مضخة حقنة بمعدل تدفق يبلغ خمسة ميكرولتر في الدقيقة لاستخدامها لاحقا. بعد الحضانة التي استمرت خمس ساعات ، أخرج الجهاز بالكامل وضعه على طبق بتري بقطر 15 سم.

ثبت الجهاز في طبق بتري باستخدام معجون لاصق ، ثم انقل طبق بتري إلى مجهر تصوير الخلايا الحية في حاضنة. قم بتوصيل الأنبوب من المحاقن بمداخل قناة التدرج الكيميائي لتوليد التدرج الكيميائي. ثم قم بتوصيل المخرج بالأنبوب الذي يؤدي إلى خزان النفايات.

قم بتشغيل مضخة الحقنة باستخدام المحاقن لتوليد التدرج الكيميائي. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنبوب عالي النقاء من المحاقن التي تحتوي على كلوريد الصوديوم والبيروجالول بمداخل قناة تدرج الأكسجين. قم بتوصيل الأنبوب بالمخرج لتجميع النفايات وتشغيل مضخة الحقنة بالمحاقن لتوليد تدرج الأكسجين.

أضف حوالي 15 مل من الماء المقطر المزدوج إلى طبق بتري للحفاظ على ترطيب الجهاز. بعد ذلك ، قم بإعداد مجهر تصوير الخلية الحية لالتقاط الصور المتقطعة بمرور الوقت والتقط صورة كل 15 دقيقة. إجراء جمع البيانات وتحليلها بالإضافة إلى توصيف التدرجات كما هو موضح في بروتوكول النص.

تظهر هنا النتائج التمثيلية للتدرجات الكيميائية المتولدة داخل جهاز الموائع الدقيقة لهجرة الخلايا. تتفق نتيجة المحاكاة العددية جيدا مع التوصيف التجريبي باستخدام محلول الفلورسين كمادة كيميائية. يمكن أيضا تقدير تدرجات المواد الكيميائية الأخرى مثل chemokine SDF-1 alpha مسبقا باستخدام المحاكاة.

يمكن تمييز تدرجات الأكسجين المتولدة داخل الجهاز تجريبيا باستخدام صبغة مضان حساسة للأكسجين. عادة ، يمكن إنشاء تدرجات الأكسجين من 1٪ في المنبع إلى 16٪ في المصب بثبات داخل الجهاز. تظهر هنا صور نموذجية بفاصل زمني تم جمعها أثناء التجارب باستخدام مجهر تصوير الخلايا الحية.

بعد تحليل الصور ، يمكن حساب مسارات هجرة خلايا A549 ومتوسط تحركاتها. في ظل عدم وجود تدرجات ، تظهر الخلايا هجرة عشوائية ومتوسط الحركة قريب من الصفر. مع تدرج كيموكين ألفا SDF-1 فقط ، تظهر الخلايا سلوكا كيميائيا وتهاجر نحو اتجاه التدرج الكيميائي العالي كما هو متوقع.

مع وجود تدرج الأكسجين فقط ، تتحرك الخلايا نحو اتجاه الأكسجين المنخفض مما يظهر سلوكا هوائيا لم تتم دراسته جيدا لخلايا الثدييات. ومن المثير للاهتمام ، أنه مع كل من تدرجات الكيموكين والأكسجين ، تتحرك الخلايا نحو التدرج منخفض الأكسجين مما يدل على أن تدرج الأكسجين له تأثيرات سائدة. تتطلب هذه الملاحظة مزيدا من الدراسة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسوية الجهاز جيدا أثناء التصنيع والتخلص من فقاعات الهواء داخل إعداد جهاز الموائع الدقيقة أثناء تجربة ترحيل الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد جهاز الموائع الدقيقة PDMS-PC وإعداد التجارب لدراسة هجرة خلايا الثدييات تحت مجموعات من التدرجات الكيميائية والأكسجين.