ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء جهاز مائعات دقيقة من البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان-البولي كربونات لدراسة هجرة الخلايا الثديية تحت تركيبات متنوعة من تدرجات كيميائية وأكسجينية متعامدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسات هجرة الخلايا الثديية، بما في ذلك تأثيرات هذه التدرجات على هجرة أنواع مختلفة من الخلايا أو الخلايا ذات الجينات المعدلة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إجراء الإعداد التجريبي بالكامل داخل حضانة تقليدية لضمان ظروف زراعة خلوية مثالية، دون الحاجة إلى إجراءات إعداد مجهدة أو أجهزة ضخمة.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو تشخيص قدرة الخلايا السرطانية على الانتقال، حيث يمكن توصيف حركة الخلايا ومختلف التدرجات المرتبطة فسيولوجياً باستخدام الجهاز الموائع الدقيقة. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول هجرة الخلايا الثديية، كما يمكن تطبيقها في دراسات خلوية أخرى مثل اختبارات الأدوية القائمة على الخلايا في المختبر بناءً على تركيبات من تركيزات الأدوية ومستويات توتر الأكسجين.

انقل جرامين من بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان، أو بوليمر PDMS الأولي، فوق القالب الذي يحتوي على أنماط القنوات المائعية في الطبقة العلوية لتكوين طبقة رقيقة من PDMS. ثم ضع القالب في جهاز تجفيف لإزالة الفقاعات الغازية من PDMS لمدة 60 دقيقة. بعد إزالة الغازات، ضع القالب طوال الليل في فرن عند درجة حرارة 60-degree Celsius لمعالجة PDMS.

تأكد من وضع القالب في مستوى أفقي. بعد تبريد القالب إلى درجة حرارة الغرفة، صب 13 جراماً إضافية من بادئ بوليمر PDMS فوق القالب، ثم قم بإزالة الغازات من PDMS في جهاز التجفيف لمدة 60 دقيقة. أغمس ببطء غشاءً من البولي كربونات (PC film) بسمك واحد ملم في طبقة PDMS الحديثة ليكون بمثابة حاجز لانتشار الغاز.

تخلص من أي فقاعات موجودة. بعد ذلك، ضع القالب في فرن بدرجة حرارة 60 °C طوال الليل. تأكد من وضع القالب على سطح أفقي.

بعد تبريد PDMS المعالج إلى درجة حرارة الغرفة، قم بقص الجهاز باستخدام مشرط إلى مساحة تبلغ حوالي 5.5 في خمسة سنتيمترات مربعة بحيث تغطي جميع أنماط القنوات. ثم، قم بنزع طبقة PDMS من القالب. بعد ذلك، قم بثقب فتحات المداخل والمخارج باستخدام خرامة خزعات بقطر اثنين مليمتر.

تُحفظ طبقة PDMS-PC العلوية المُصنّعة بعيداً عن الغبار المحيط لاستخدامها في عملية التجميع لاحقاً. ولتجميع الجهاز، توضع أولاً طبقة PDMS-PC العلوية المُصنّعة والرقاقة التي تحتوي على غشاء PDMS المكون بواسطة الطلاء الدوراني في جهاز معالجة السطح ببلازما الأكسجين، بحيث تكون أسطح الترابط مواجهة للأعلى. تُعالج أسطح PDMS ببلازما الأكسجين بقدرة 90 وات لمدة 40 ثانية.

قم بربط الطبقة العلوية بغشاء PDMS فوراً بعد معالجة السطح ببلازما الأكسجين. ضع ثقلاً فوق الطبقات المترابطة وضعها في فرن عند درجة حرارة 60-degree Celsius طوال الليل لتعزيز الترابط. وبمجرد أن تبرد الطبقات المترابطة إلى درجة حرارة الغرفة، قم بقص الغشاء المرتبط بالطبقة العلوية باستخدام مشرط إلى مساحة تبلغ تقريباً 5.5 في خمسة square centimeters.

قم بنزع الهيكل المترابط من رقاقة السيليكون، واثقب فتحات عند المداخل والمخارج لقناة التدرج الكيميائي باستخدام خرامة خزعات بقطر 2 ملم. بعد ذلك، ضع الطبقة العلوية المترابطة بالغشاء وطبقة PDMS السفلية المصنعة في جهاز معالجة السطح ببلازما الأكسجين، بحيث تكون أسطح الترابط مواجهة للأعلى. ولتنشيط أسطح PDMS، استخدم البلازما بقدرة 90 واط لمدة 40 ثانية.

قم بتجميع الطبقتين العلوية والسفلية معاً للربط فوراً بعد المعالجة السطحية. ضع الثقل فوق الجهاز المربوط بالكامل واتركه طوال الليل في فرن عند درجة حرارة 60 °C. وفي اليوم التالي، أخرج الجهاز المصنع بالكامل من الفرن واتركه ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة.

ابدأ مقايسة هجرة الخلايا في القنوات الميكروية بتحضير الخلايا في الجهاز كما هو موضح في البروتوكول النصي. في اليوم الثاني، اشفط الوسط من الخلايا التي تم استزراعها منذ اليوم صفر واغسل الخلايا بخمسة مليلتر من DPBS مرتين. اشفط DPBS وأضف اثنين مليلتر من Trypsin-EDTA، ثم حضن الخلايا في الحاضنة لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا عن سطح الدورق.

بمجرد انفصال الخلايا وتعلقها في المحلول، أضف ثمانية ملليلتر من الوسط الخالي من المصل إلى القارورة. انقل جميع السوائل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وقم بطردها مركزياً عند 140 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي وأضف كمية مناسبة من الوسط الخالي من المصل للوصول إلى كثافة خلوية نهائية تبلغ مليون خلية لكل ملليلتر.

بعد ذلك، أخرج الجهاز الموائع الدقيقة الذي تم تحضيره في اليوم الأول كما هو موضح في البروتوكول النصي. استخدم حقنة سعة 1 مل مع إبرة غير مدببة بقياس 14 gauge لحقن الوسط الخالي من المصل عبر مخرج قناة التدرج الكيميائي حتى يتدفق الوسط من كلتا الإبرتين عند المداخل. ثم، احقن 200 µL من معلق الخلايا من مخرج قناة التدرج الكيميائي.

افحص غرفة زراعة الخلايا في الجهاز تحت المجهر للتأكد من إدخال الخلايا إلى القناة الموائع الدقيقة. بعد ذلك، ضع الجهاز في حاوية رطبة واحفظه في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمس ساعات لتعزيز التصاق الخلايا بسطح الجهاز. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير المادة الكيميائية بالتركيز المطلوب في وسط خالٍ من المصل.

اسحب الوسط الخالي من المصل مع وبدون المادة الكيميائية في حقنتين منفصلتين سعة 3 مل متصلتين بأنابيب عالية النقاء. ثم، قم بتثبيت الحقنتين على مضخة حقن بمعدل تدفق قدره 1 µL/min لاستخدامها لاحقاً. بعد ذلك، قم بتحضير 15 mL من محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M و 15 mL من محلول بيروجالول بتركيز 200 mg/mL.

اسحب محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى سرنجة سعة 15 ملليلتر متصلة بأنبوب PFTE عالي النقاء، واسحب محلول البيروجالول إلى سرنجة سعة 15 ملليلتر متصلة بأنبوب عالي النقاء. ثبّت السرنجات على مضخة سرنجات بمعدل تدفق قدره 5 µL في الدقيقة لاستخدامها لاحقاً. بعد فترة حضانة مدتها خمس ساعات، أخرج الجهاز بالكامل وضعه في طبق بتري بقطر 15 سم.

ثبّت الجهاز في طبق بتري باستخدام معجون لاصق، ثم انقل طبق بتري إلى مجهر تصوير الخلايا الحية الموجود داخل حاضنة. صِل الأنابيب الممتدة من المحاقن بمنافذ قناة التدرج الكيميائي لتوليد التدرج الكيميائي. بعد ذلك، صِل المخرج بالأنبوب الذي يؤدي إلى خزان النفايات.

قم بتشغيل مضخة السرنجة المزودة بالسرنجات المخصصة لتوليد التدرج الكيميائي. بعد ذلك، قم بتوصيل الأنابيب عالية النقاء من السرنجات التي تحتوي على كلوريد الصوديوم والبيروجالول بفتحات الدخول في قناة تدرج الأكسجين. قم بتوصيل الأنبوب بالمخرج لتجميع النفايات، ثم قم بتشغيل مضخة السرنجة المزودة بالسرنجات المخصصة لتوليد تدرج الأكسجين.

أضف حوالي 15 milliliters من الماء المقطر مرتين إلى طبق Petri للحفاظ على ترطيب الجهاز. ثم، قم بإعداد مجهر تصوير الخلايا الحية لالتقاط الصور بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) والتقط صورة كل 15 دقيقة. قم بإجراء جمع البيانات وتحليلها، بالإضافة إلى توصيف التدرجات كما هو موضح في البروتوكول النصي.

تظهر هنا نتائج ممثلة للتدرجات الكيميائية التي تم إنشاؤها داخل الجهاز الموائع دقيقية لهجرة الخلايا. تتوافق نتيجة المحاكاة العددية بشكل جيد مع التوصيف التجريبي باستخدام محلول الفلوريسين كمادة كيميائية. كما يمكن تقدير تدرجات مواد كيميائية أخرى، مثل الكيموكين SDF-1 alpha، مسبقاً باستخدام المحاكاة.

يمكن توصيف تدرجات الأكسجين المتولدة داخل الجهاز تجريبيًا باستخدام صبغة فلورية حساسة للأكسجين. وعادةً ما يمكن إنشاء تدرجات أكسجين مستقرة داخل الجهاز تتراوح من 1% في المنبع إلى 16% في المصب. تظهر هنا صور نمطية بنظام الفاصل الزمني تم جمعها أثناء التجارب باستخدام مجهر تصوير الخلايا الحية.

بعد تحليل الصور، يمكن حساب مسارات هجرة خلايا A549 ومتوسط حركتها. وفي غياب التدرجات، تُظهر الخلايا هجرة عشوائية ويكون متوسط الحركة قريبًا من الصفر. أما عند وجود تدرج كيموكين SDF-1 alpha فقط، فتُظهر الخلايا سلوكًا جذبياً كيميائياً وتهاجر نحو اتجاه تدرج الكيموكين المرتفع كما هو متوقع.

عند وجود تدرج في الأكسجين فقط، تتحرك الخلايا باتجاه التركيز المنخفض للأكسجين، مما يظهر سلوكاً توجيهياً هوائياً (aerotactic behavior) لم يتم دراسته بشكل كافٍ في الخلايا الثديية. ومن المثير للاهتمام أنه عند وجود تدرجات لكل من الكيموكين والأكسجين معاً، تتحرك الخلايا نحو تدرج الأكسجين المنخفض، مما يشير إلى أن تدرج الأكسجين له تأثيرات مهيمنة. وتتطلب هذه الملاحظة مزيداً من الدراسة.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تسوية الجهاز جيداً أثناء عملية التصنيع، والتخلص من الفقاعات الهوائية داخل إعداد جهاز الموائع الدقيقة خلال تجربة هجرة الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير جهاز موائع دقيقة من PDMS-PC وإعداد التجارب لدراسة هجرة الخلايا الثديية تحت تأثير مزيج من التدرجات الكيميائية وتدرجات الأكسجين.