بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الخصائص الكهربائية للخلايا القابلة للاستثارة في ظروف فسيولوجية غير بضعية باستخدام أجنة zebrafish مع مؤشر جهد كهربائي جيني (GEVI) يعتمد على تقنية FRET. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق ببيولوجيا الخلايا القابلة للاستثارة مثل العصبونات. على سبيل المثال، يمكن استخدام هذه الطرق لتحليل دور الاستثارة في إمراضية الاضطرابات العصبية.

يعتمد هذا النهج على استخدام أجنة سمك الزيبرا الشفافة التي تعبّر عن مؤشرات جهد مشفرة جينيًا قائمة على تقنية FRET. يتيح هذا النهج قياس الخصائص الكهربائية للخلايا في الجسم الحي بطريقة غير باضعة. وبذلك، يمكن لهذه الطريقة توفير رؤى حول استثارة العصبونات الشوكية في أجنة سمك الزيبرا.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى سواء كانت في المختبر (in-vitro) أو في الكائن الحي (in-vivo) والتي تكون قابلة لدراسات التصوير. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير خليط PCR لتضخيم التسلسل المشفّر للمستشعر الحيوي Mermaid. قم بتسخين خليط PCR لمدة 15 ثانية عند 95 درجة مئوية.

قم بعملية التمهيد لمدة 15 ثانية عند 50 درجة مئوية، ثم قم بإطالة السلسلة لمدة أربع دقائق عند 72 درجة مئوية لمدة إجمالية قدرها 35 دورة. بعد ذلك، قم بتنقية منتج PCR blunt المحدد باستخدام طقم تنقية الجل التجاري. ثم قم باستنساخ قطعة DNA في ناقل pCMV-SC blunt، وقم بكسر البلازميد الموجب لـ Mermaid خطياً باستخدام إنزيم القطع SmaI لإدراج محفز HuC.

قم بإعداد تفاعل القطع التقييدي في حجم إجمالي قدره 20 µL، وحضّن التفاعل عند 25 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بتنقية البلازميد المهضوم باستخدام طقم تنقية الهلام التجاري. ثم قم بتضخيم محفز HuC عن طريق تفاعل PCR باستخدام PFU DNA polymerase والحمض النووي الجينومي لسمك الزيبرا كقالب.

قم بتحضير خليط PCR. بعد خطوة أولية لمدة دقيقتين عند 95 درجة مئوية، قم بتسخين خليط PCR لمدة 15 ثانية عند 95 درجة مئوية. ثم قم بعملية الارتباط (priming) لمدة 15 ثانية عند 50 درجة مئوية، والتطويل (elongation) لمدة أربع دقائق عند 72 درجة مئوية، وذلك لمدة إجمالية تبلغ 35 دورة.

بعد ذلك، يتم تنقية ناتج PCR blunt المحدد باستخدام الهلام. يتم ربط كميات متساوية المولات من DNA كل من pCMV-SC Mermaid و pHuC المنقى باستخدام 1 µL من T4 DNA ligase و 1 µL من Specific 10x buffer في حجم إجمالي قدره 10 µL. بعد ذلك، يتم تحضين التفاعل لمدة 16 ساعة عند 4 °C.

قم بتحويل حصة من الخلايا المختصة باستخدام خمسة µL من تفاعل الربط. اختر المستعمرات الموجبة لـ pHuC والتي تم إدراج المحفز فيها بالاتجاه الصحيح عن طريق الهضم المزدوج بإنزيمات CEL1-EcoRV. انقل المستعمرات إلى أنابيب سعة 15 mL واحضنها عند 37 °C طوال الليل.

بعد ذلك، استخلص البلازميد من الخلايا وقم بإعداد تفاعل التقييد المزدوج CEL1-EcoRV، ثم حضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، قم بتشغيل التفاعلات على هلام الأجاروز. في هذا الإجراء، انقل البيض المخصب الذي تم الحصول عليه من أسماك الزيبرا البالغة من النوع البري أو sod1G93R إلى طبق بتري بقطر 10 مليمتر.

اشطف الأجنة في ماء أسماك بارد. ثم قم فوراً بحقنها مجهرياً في المح، بـ 200 picograms من بلازميد pHuC-Mermaid. بعد ذلك، انقل الأجنة إلى طبق بتري واحضنها في ماء أسماك عند درجة حرارة 28 °C حتى تصل إلى المرحلة التنموية المطلوبة للتحليلات التالية.

لإجراء تحليل لالتفاف الذيل التلقائي، انقل الأجنة إلى طبق بتري دائري بقطر 90 ملم مملوء بماء الأسماك الذي يحتوي على 0.2% DMSO. ثم قم بإزالة الغشاء الكوريوي يدويًا باستخدام ملقطين للمجوهرات ذات رؤوس حادة أو إبر. بعد ذلك، قم بحضن الأجنة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 28 °C.

باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر ستيريو، يتم الكشف عن التفاف الذيل في درجة حرارة الغرفة خلال تسجيل فيديو لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، يتم الحصول على السلسلة الزمنية بدقة زمنية تبلغ 30 إطاراً في الثانية. ثم تُحسب ترددات التفافات الذيل التلقائية عن طريق عد عدد الانحناءات لكل وحدة زمنية.

لتقييم تأثير عقار riluzole، انقل الأجنة إلى طبق بتري جديد بقطر 90 مليمتر مملوء بمياه الأسماك التي تحتوي على 5 µM من riluzole. بعد ذلك، قم بتحضين الأجنة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 28 °C قبل تسجيل مقطع فيديو لمدة دقيقة واحدة وإجراء التحليل السلوكي. الآن، قم بتثبيت الأجنة في عمر 20 إلى 24 hpf في Agarose منخفض نقطة الانصهار بتركيز 1% في مياه الأسماك داخل طبق تصوير ذو قاعدة زجاجية بقطر 35 مليمتر عند درجة حرارة 37 °C.

قم بتوجيه الأجنة على جوانبها وانتظر حتى يتصلب الأجاروز في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل طبق التصوير إلى منصة مجهر بؤري (confocal microscope). حدد العصبونات الحركية التي تعبر عن المستشعر الحيوي عن طريق استثارة monomeric Umikinoko-Green باستخدام ليزر أرغون بطول موجي 488 nanometer.

بعد ذلك، قم بضبط الانبعاث بين 495 و525 نانومتر ثم اضغط على زر التسجيل. ولإجراء قياس FRET، قم باستثارة mUKG، وهو المانح في زوج Fret، باستخدام ليزر 488 نانومتر. وبالتزامن مع ذلك، استخدم مضاعفي ضوئيين للكشف عن الفلورة المنبعثة من المانح والفلورة المنبعثة من المستقبل monomeric Kusibira-Orange.

في بداية التجربة، قم بتحسين الكسب (gain) والإزاحة (offset) للمضاعف الضوئي الأول حيث يتم تسجيل فلورة mUKG، وحافظ عليهما ثابتين طوال الجلسة. لضبط الإزاحة، قم بتغيير لون الصورة إلى قيم الشدة باستخدام جدول البحث Q. أثناء المسح والليزر مطفأ، استخدم شريط تمرير الإزاحة بحيث تكون شدة بكسلات الخلفية أعلى قليلاً من الصفر.

باستخدام جدول البحث نفسه، قم بتشغيل الليزر. وأثناء المسح، استخدم منزلق الكسب (gain slider) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى الحد الأقصى، مع الحرص على تجنب البكسلات المشبعة. في نافذة الاستحواذ الخاصة بالبرنامج، اختر وضع الاستحواذ xyt وحجم مجال صورة يبلغ 512 في 64 بكسل من القائمة المنسدلة.

بعد ذلك، اضبط تسجيل التغيرات في جهد العصبونات الشوكية للجنين بحيث يتم التقاط مستوى XY واحد كل 30 milliseconds لمدة دقيقة واحدة. ولتقييم تأثير إعطاء riluzole على إزالة استقطاب الغشاء في العصبون نفسه، قم بالحصول على مجموعة بيانات جديدة بعد خمس دقائق من إضافة مياه الأسماك التي تحتوي على 5 micromolar من riluzole. في هذا المقطع المرئي، تم تسجيل الالتفافات التلقائية، وهي استجابات حركية تتكون حصرياً من انقباض كامل للجسم يؤدي إلى وصول طرف الذيل إلى الرأس، وذلك في المرحلة من 20 إلى 24 hpf في وسط أسماك عادي.

يظهر هذا المقطع عمليات الالتفاف التلقائية للجنين بعد التحضين في ريلوزول بتركيز 5 micromolar. ولاختبار ما إذا كانت التغيرات في النشاط الكهربائي للعصبونات الحركية الشوكية هي الأساس للتغيرات التي أحدثها الريلوزول في تردد الالتفاف التلقائي، تمت دراسة جهد الغشاء في العصبونات الحركية الشوكية للجنين بطريقة غير باضعة تماماً عن طريق قياس نسبة كثافة الفلورة لزوج المانح-المستقبل في تقنية FRET الخاصة بالمستشعر الحيوي Mermaid. تم تحديد العصبونات الحركية الشوكية الأولية التي تعبر عن المستشعر الحيوي، وتم تسجيل أنشطة إزالة الاستقطاب التلقائية الأساسية الخاصة بها.

إلى جانب الانخفاض في تكرار حركات التفاف الذيل، أدى إعطاء عقار riluzole إلى تقليل تكرار أحداث إزالة الاستقطاب التلقائية. وبمجرد إتقان هذا النهج، سيتمكن الباحثون من دراسة الخصائص الكهربائية للشبكات العصبية في الأجنة السليمة، مما يحافظ بشكل كامل على تعقيد التفاعلات بين الخلايا في النظام الوظيفي النامي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ارتباط النشاط الكهربائي للعصبونات الشوكية بتكرار التفافات الذيل التلقائية.