باستخدام البيولوجيا الاصطناعية إلى المهندس الخلايا الحية تتفاعل مع المواد القابلة للبرمجة

الهدف العام من هذه الإجراءات هو استخدام بكتيريا E.coli المهندسة اصطناعياً للتحكم في أسطح المواد القابلة للبرمجة ومعالجتها من خلال الجمع بين التعديل الجيني واستراتيجيات وظيفية الأسطح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات مثل الطب الجزيئي والرصد البيئي. ومن خلال استخدام خلايا مبرمجة جينياً لتفسير البيئة المحلية وتعديل المادة الوظيفية وفقاً لذلك، فإننا نوفر أداة نمطية لمجموعة واسعة من التطبيقات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرة الخلايا الحية على العمل كمستشعرات ديناميكية قادرة على قراءة الظروف المحيطة بها ومعالجتها وتسجيلها عبر واجهات وظيفية. بعد تحضير المحاليل وجمع الطافي الغني بالبيوتين من بكتيريا E.coli المنتجة للبيوتين وفقاً للبروتوكول النصي، أضف 1.4 µL من محلول SPDP إلى 20 µL من الستريبتفيدين أو محلول SA. غلف الأنبوب بورق الألمنيوم واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف للسماح لـ SPDP الرابط التشابكي بالارتباط بـ SA عبر مجموعة أمين، مما يؤدي إلى تكوين SA منشط بـ pyridyldithio. بعد فترة الحضانة، أضف 2.4 µL من محلول DTT إلى الأنبوب واترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح بانقسام pyridine-2-thione مما ينتج عنه SA منشط بالسلفهيدريل. بعد ذلك، أضف 7.5 µL من محلول SCC إلى 72 µL من محلول HRP، ثم غلفه بورق الألمنيوم واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف.

يؤدي ذلك إلى تكوين HRP منشط بالميليميد مرتبط بمجموعة أمين. اخلط 17 µL من محلول البيوتين LC-LC مع 200 µL من محلول BSA، ثم غلف الأنبوب برقائق الألومنيوم واحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف. تسمح هذه الخطوة باقتران البيوتين بـ BSA عبر رابطة أميدية.

انقل محلول SA-SPDP، وHRP-SMCC، ومحلول البيوتين المقترن بـ BSA إلى مكثفات طرد مركزي منفصلة في أنابيب دوران. قم بطرد SA-SPDP مركزياً عند 10,000 ×g حتى يصل حجم الأنبوب إلى 100 microliters أو لمدة 16 دقيقة، ثم املأ أنبوب الدوران إلى 500 microliters باستخدام PBS-EDTA قبل تكرار عملية الدوران وإضافة PBS-EDTA خمس مرات أخرى. بعد تركيز المحلول عن طريق الدوران وصولاً إلى 100 microliters، قم بتخزين المخزون عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

بالنسبة لـ HRP SMCC، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 10,000 ×g حتى يصل الحجم إلى 25 µL أو لمدة 16 دقيقة. املأ أنبوب الطرد المركزي إلى 4500 µL باستخدام PBS قبل تكرار عملية الطرد المركزي وإضافة PBS خمس مرات أخرى. بعد تركيز المحلول عن طريق الطرد المركزي وصولاً إلى 100 µL، قم بتخزين المخزون عند 4 °C.

بالنسبة لـ BSA biotin، قم بطرد العينة مركزياً عند 10,000 ×g حتى يصل الحجم إلى 100 µL أو لمدة 12 دقيقة، ثم املأ أنبوب الطرد المركزي حتى 500 µL باستخدام PBS. بعد تكرار عملية الطرد المركزي وإضافة PBS أربع مرات إضافية، قم بطرد الأنبوب مركزياً حتى يصل الحجم إلى 100 µL أو لمدة 12 دقيقة، ثم أضف 100 µL من PBS إلى الأنبوب واحفظ المحلول المخزون عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، امزج 25 µL من HRP بتركيز 10 mg/mL مع 25 µL من محلول SA بتركيز 10 mg/mL واحفظ الأنبوب عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل، ثم قم بتحضير حصتين من BSA biotin في PBS عن طريق إضافة 10 µL من مخزون BSA biotin إلى 490 µL من PBS.

قم بنقل 100 µL من المحلول إلى كل بئر في طبق يحتوي على 96 بئراً. غلف الطبق برقائق الألومنيوم واحضه عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 200 µL من 05%Tween 80 وBPS إلى الآبار.

قم بتحضين الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، ثم اسحب السائل وصفّه. بعد تكرار عملية الغسيل ثلاث مرات، أضف 200 µL من محلول casing بتركيز 0.5% إلى كل بئر، ثم حضن الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. بعد إجراء جولة أخرى من عمليات الغسيل كما سبق، اخلط 12 mL من محلول casing بتركيز 0.5% مع 7.5 µL من Tween 80 بتركيز 0.5%، ثم استخدم هذا المحلول لتخفيف المحلول المخزون من SA-HRP بنسبة 1 إلى 10,000.

قم بنقل 80 µL من SA-HRP المخفف إلى كل بئر من آبار صفيحة ذات 96 بئرًا، ثم أضف 20 µL من عينة البيوتين المُحضرة إلى كل بئر في الصفيحة. حضّن الصفيحة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة. تسمح هذه الخطوة بحدوث ارتباط تنافسي بين البيوتين الحر و BSA biotin المثبت على مواقع ارتباط SA-HRP.

بعد غسل الطبق ثلاث مرات كما سبق، قم بتحضير محلول بحجم 20 milliliter يتكون من خلات الصوديوم بتركيز 50 millimolar، وTMB بتركيز 1%، وبيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3% بنسبة 1,000 إلى 10 إلى واحد. أضف 200 microliters من المحلول إلى كل بئر من آبار الطبق، ثم قم بلفه بورق القصدير وتحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اسحب 50 microliters من حمض الكبريتيك بتركيز two molar بواسطة الماصة إلى كل بئر لإيقاف التفاعل، ثم استخدم قارئ الأطباق لقياس OD 450.

بعد تحضير المحاليل وفقاً للبروتوكول المكتوب، أضف 7.5 µL من LC-LC biotin إلى 72 µL من HRP. غلف المحلول بورق الألمنيوم وحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ونصف مع الرج. تؤدي هذه الخطوة إلى ربط biotin بـ HRP عبر رابطة أميدية.

انقل المحلول إلى مُركّز طرد مركزي داخل أنبوب دوران وقم بطرد المحلول مركزياً عند 10,000 ×g حتى يصل الحجم إلى 100 µL أو لمدة 12 دقيقة، ثم استخدم PBS لملء أنبوب الدوران حتى 500 µL وكرر عملية الطرد المركزي وإضافة المحلول المنظم أربع مرات. بعد ذلك، أضف 100 µL من SA بتركيز 0.17 µg/mL في PBS إلى كل بئر من طبق يحتوي على 96 بئراً. غلف الطبق بورق القصدير واحضنه عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

لغسل آبار اللوحة، يتم سحب 200 µL من Tween 80 بتركيز 0.5% بالماصة ووضعها في كل بئر. تُحضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ثم يُسكب السائل. بعد تكرار عملية الغسل ثلاث مرات أخرى، يتم إضافة 200 µL من محلول التغليف (casing solution) بتركيز 0.5% إلى الآبار.

قم بتحضين الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة قبل غسل الآبار ثلاث مرات كما سبق. وباستخدام محلول biotin HRP المركز والمغسول الذي تم تحضيره مسبقاً، خفف المحلول المخزون من biotin HRP بنسبة 1 إلى 10,000، ثم أضف 80 µL من المحلول إلى آبار طبق يحتوي على 96 بئراً. أضف 20 µL من عينة biotin المحضرة إلى كل بئر من آبار الطبق، ثم حضن الطبق عند 37 °C لمدة ساعة واحدة للسماح بالارتباط التنافسي بين biotin الحر و biotin HRP على مواقع ارتباط SA المثبتة.

بعد غسل الآبار ثلاث مرات كما سبق، قم بتحضير محلول بحجم 20 milliliter يتكون من خلات الصوديوم بتركيز 50 millimolar، و1%TMV، و3% hydrogen peroxide بنسبة 1,000 إلى 10 إلى واحد. أضف 200 microliters من المحلول إلى كل بئر من آبار اللوحة، ثم غطِّها بورق القصدير، واتركها للحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وبعد ذلك أضف 50 microliters من حمض الكبريتيك بتركيز two molar إلى كل بئر لإيقاف التفاعل. وفي النهاية، استخدم قارئ الأطباق لقياس OD 450.

تمت زراعة خلايا E.coli MG1655 البرية المهندسة والمحفزة ومراقبتها في وسط غذائي أدنى، بالإضافة إلى وسط غذائي أدنى مدعم بـ DTB و/أو IPTG. توضح هذه المخططات قراءات OD 600 التي تم قياسها كل خمس دقائق لمدة 24 ساعة. في هذه التجربة، استُخدم البروتين الفلوري mCherry بدلاً من جين bioB لتمكين قياس ملف التحفيز عند تحفيز الخلايا المهندسة باستخدام IPTG.

تظهر هذه النتائج فعالية الشبكة الجينية القابلة للاستحثاث. تظهر هنا الإشارات الضوئية عند OD 450 استجابةً لتركيزات مختلفة من البيوتين لكل من مخططي السطح الوظيفي غير المباشر والمباشر. في هذه التجربة، استُخدمت نواتج الخلايا المهندسة المستحثة لتعديل السطح الوظيفي كيميائياً.

تُعرض تركيزات البيوتين المختلفة كما تم قياسها بواسطة السطح الوظيفي بنظام التحكم غير المباشر للخلايا البرية، والخلايا غير المحفزة التي تحتوي على بلازميد pKE1-lacI-bioB، والخلايا المحفزة التي تحتوي على بلازميد pKE1-lacI-bioB. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن هندسة الخلايا وراثياً في غضون يومين، بينما يمكن إجراء تقنيات وظيفية السطح المباشرة وغير المباشرة في خمس ساعات لكل منهما إذا تم تنفيذهما بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب تلوث المزرعة الخلوية البكتيرية وتغطية الأسطح أثناء عملية الوظيفية لتجنب التبييض الضوئي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وظيفية الأسطح لكل من مخططات التحكم المباشرة وغير المباشرة. لا تنسَ أن العمل بمادة بروميد الإيثيديوم يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.