تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد بروتينات جديدة مرتبطة بالجليد أو IBPs من النباتات عن طريق اختبار نشاط ربط الجليد وعزل الببتيدات الأصلية باستخدام تنقية تقارب الجليد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تحمل تجميد النبات ، وتحديدا البروتينات المرتبطة بالجليد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لك بعزل البروتينات المرتبطة بالثلج عن المستخلصات الأصلية دون استخدام طرق تنقية معقدة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث قد يكون من الصعب تصور إعداد الجهاز. ابدأ هذا البروتوكول بإعداد جهاز splat كما هو موضح في بروتوكول النص. للحث على التعبير عن البروتينات المرتبطة بالجليد ، أو IBPs ، في الأعشاب التي تتحمل التجمد أو غيرها من الأنواع النباتية التي تتحمل التجمد ، والنباتات الباردة لمدة تصل إلى أسبوع عند أربع درجات مئوية في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة.

احصل على ما يقرب من 0.1 جرام من أنسجة الأوراق عن طريق القطع عند قاعدة الساق ثم وضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. قم بتجميد العينة على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. لتحلل الخلايا ، قم بطحن عينة الأنسجة إلى مسحوق ناعم باستخدام ملاط ومدقة تحت النيتروجين السائل.

تأكد من أن النيتروجين السائل لا يتبخر أثناء عملية التجانس. ضع العينات الأرضية على الفور على الجليد واترك النيتروجين السائل يتبخر تماما. ثم أضف ملليلترا واحدا من مخزن استخلاص البروتين الأصلي والماصة للخلط.

رج العينات برفق طوال الليل عند أربع درجات مئوية وقم بإجراء الخطوات المتبقية في نفس درجة الحرارة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للعينات عند حوالي 1،600 مرة G لمدة خمس دقائق. احتفظ بالجزء القابل للذوبان وجهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق إضافية إذا استمر الحطام الخلوي.

يمكن تخزين العينات المصفاة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. صب 100 مل من الهكسان في الغرفة الخارجية التي تم إعدادها مع الفيلم المستقطب وأضف خمسة إلى ستة حبات تجفيف لمنع تراكم الرطوبة على الشرائح. ثم أضف كمية صغيرة من الشحوم المفرغة إلى اللوحة التي تغطي الحمام ولفها لضمان إحكام الإغلاق ومنع تبخر الهكسان.

قبل 40 دقيقة من بدء التجربة ، ضع كتلة التبريد في صندوق من البوليسترين أسفل الأنبوب البلاستيكي مباشرة وقم بتغطيته بالكامل بالثلج الجاف. قبل البدء في الفحص ، تأكد من أن الأنبوب مستو. ثم قم بإزالة الثلج الجاف من أعلى الكتلة الباردة.

أولا ، اختبر هذا الإجراء بالماء لتحديد مكان سقوط العينة على كتلة التبريد. اغمس الطرف القابل للتصرف المثبت على ماصة أوتوماتيكية في زيت الغاطس، مما سيسمح للعينة بالسقوط بدلا من الالتصاق بالجزء الخارجي من الماصة. استخدم منشفة ورقية لإزالة أي زيت زائد.

ثم استنشق 10 ميكرولتر من الماء. ضع الماصة مباشرة فوق الأنبوب البلاستيكي قبل إطلاق الماء. يجب سماع صوت splat مميز عندما يصطدم الماء بكتلة التبريد ، مما يخلق طبقة أحادية من بلورات الجليد.

بعد ذلك ، ضع شريحة غطاء مجهر زجاجي على علامة السقوط التي تم تحديدها بالماء. مباشرة قبل بدء الفحص ، قم بتشغيل مصدر الضوء واكشط أي جليد يتشكل في قاع الغرفة الزجاجية. ثم قم بإجراء اختبار splat مع العينة ، كما هو الحال بالنسبة للماء ، وإطلاق 10 ميكرولترات من العينة على شريحة الغطاء الزجاجي لإنشاء طبقة أحادية من بلورات الثلج.

قم بإزالة شريحة المجهر بسرعة وبعناية من الكتلة الباردة باستخدام الملقط وضعها في حمام الهكسان فوق الفيلم المستقطب. بالنظر تحت المجهر ، ضع شريحة المجهر في مجال الرؤية واضبط العدسة الموضوعية بحيث يسمح الاستقطاب المتقاطع بتصور بلورات الجليد عالية التباين. قم بتوصيل الكاميرا بالمجهر واضبط الإعدادات على الماكرو للسماح بالتصور الواضح لبلورات الثلج والتقاط الصورة.

كرر هذه الخطوات لجميع العينات. عادة ما تضع ما يصل إلى ست شرائح مع عينة مختلفة في غرفة الهكسان. بمجرد الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء.

ثم ضع صفيحة بلاستيكية فوق حمام الهكسان ، مع ضمان إحكام الإغلاق ، والسماح لبلورات الثلج بالتلدين طوال الليل. بعد الحضانة ، التقط صورا لأفلام الجليد كما كان من قبل. بعد التأقلم البارد مع الأنسجة النباتية كما كان من قبل ، اجمع ما يقرب من 100 إلى 150 جراما من الكتلة الحيوية الأرضية في أنابيب سعة 20 ملليلترا.

قم بتجميد العينات على الفور ، واحتفظ بها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل الاستخدام. قم بإعداد العينة كما كان من قبل ، باستخدام نسبة واحد إلى واحد لإعادة تعليق أنسجة الأوراق. استخدم أقراص مثبطة للبروتياز إضافية لتجنب تدهور IBPs بواسطة البروتياز الذاتي

لإزالة الحطام الخلوي ، نخل المحللة من خلال طبقتين من القماش القطني ثلاث مرات. حبيبات الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 30,000 مرة G لمدة 40 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم قم بزيادة حجم العينة إلى 120 مل باستخدام المخزن المؤقت لاستخراج البروتين الأصلي واستخدم اللايساد على الفور لتنقية تقارب الجليد لتجنب أي فقدان لنشاط ربط الجليد.

بعد تبريد إصبع الثلج إلى 0.5 درجة مئوية تحت الصفر، اغمره لاحقا في أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على ماء مقطر بارد. أضف القليل من رقائق الثلج لتسهيل نوى الجليد والسماح بتكوين طبقة رقيقة من الثلج على الإصبع. تستغرق هذه العملية عادة ما بين 20 و 30 دقيقة.

ضع العينة في دورق زجاجي سعة 150 مليلتر يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي صغير ، يتم وضعه في وعاء من البوليسترين فوق النمام المغناطيسي. تأكد من أن إصبع الثلج في المنتصف وخفضه في منتصف العينة السائلة على الأقل. ثم أغلق الحاوية.

اسمح للبرنامج بالعمل لمدة يومين تقريبا ، والتحقق منه كل 24 ساعة. بمجرد تجميد 50٪ من العينة ، أوقف البرنامج. وسيؤدي دمج IBPs في نصف الكرة الجليدي إلى حفر الجليد.

لإزالة نصف الكرة الجليدية ، قم بتسخين المسبار إلى أربع درجات مئوية. ثم اشطف نصف الكرة بالماء المقطر لإزالة البروتين غير المرتبط وذوبان الجليد عند أربع درجات مئوية. إذا كان نصف الكرة الجليدية لا يزال يحتوي على صبغة ، أو لزيادة تنقية العينة ، كرر خطوات التنقية مرتين إلى ثلاث مرات.

تظهر هنا مقتطفات تم جمعها من عنصر تحكم عازل يفتقر إلى IBPs ومقتطفات من نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا من النوع البري التي لا تحتوي على IBPs. بعد 18 ساعة ، لا يمكن للتحكم في المخزن المؤقت ومستخلصات A.thaliana تقييد نمو بلورات الثلج. في المقابل ، فإن بلورات الجليد الصغيرة التي شوهدت مع مقتطفات من A.thaliana المعدلة وراثيا التي تعبر عن IBPs من Lolium perenne المتأقلم مع البرد تقيد نمو بلورات الجليد بشكل كبير.

بعد الجولة الأولى من التنقية ، تشير الدرجة العالية من الحفر الجليدي على سطح نصف الكرة الأرضية إلى أن IBPs قد امتصت إلى الجليد وعدلت نمو بلورات الجليد. لإزالة المواد المذابة والأصباغ والبروتينات الملوثة الإضافية ، تم استخدام جولة ثانية من تقارب الجليد ، مما أدى إلى نصف كرة جليدي أكثر وضوحا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تقييم تشكيل الجليد والتباطؤ الحراري باستخدام مقياس التناضح نانولتر من أجل توصيف البروتينات المرتبطة بالجليد.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إرسال الكسور المعزولة لقياس الطيف الكتلي من أجل تحديد تسلسل الببتيد.