تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

في حين يتم تجنيد البلاعم تسلل باستمرار إلى أنسجة الكبار من السلائف تعميم، والبذور المقيمين البذور الأنسجة أثناء التنمية، حيث يتم الحفاظ عليها دون مزيد من المدخلات من الأسلاف. تم تحديد الأسلاف للبلاعم المقيمين مؤخرا. هنا، نقدم أساليب لتخطيط مصير الجينات من الأسلاف بلعم المقيمين.

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف أسلاف المكونة للدم في كيس الصفار وذريتهم في الجسم الحي باستخدام نظام رسم خرائط المصير الناجم عن تاموكسيفين الفأر وقياس التدفق الخلوي. يمكن أن يساعد هذا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة فيما يتعلق بتطوير وتمايز أسلاف المكونة للدم التي تختلف عن الخلايا الجذعية المكونة للدم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة أسلاف المكونة للدم التي تم تصنيفها في غضون فترة زمنية محدودة والذرية مثل البلاعم المقيمة أثناء التطور والبلوغ.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب كمية الخلايا للأنسجة الجنينية والحجم الكبير للعينات المعالجة في وقت واحد. لبدء التجربة ، قم أولا بنقل قرون رحم الفأر المقطعة إلى طبق بتري 10 ملم مليء بحوالي 30 مل من PBS المثلج. بعد ذلك مباشرة ، أمسك طبقات عضلات الرحم في نهاية عنق الرحم من القرن وحرك مقصا دقيقا بين طبقة العضلات والأنسجة المتساقطة لتحرير الأجنة.

ثم باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة غشاء Reichert وإزالة المشيمة. قم بتشريح كيس الصفار برفق وانقله إلى صفيحة زراعة الأنسجة ذات 24 ملحوما مملوءة ب 0.5 مل من محلول الهضم. بعد قطع الأوعية السرية والجسم الزجاجي ، قم بنقل الجنين على الفور إلى صفيحة زراعة أنسجة 12 ملحومة مملوءة ب 2 ملليلتر من 10 ملليمولات من EDTA المثلج.

بعد إزالة الرأس من الجنين بمقص ناعم حاد ، احتضان الجسم والرأس على الجليد لمدة 10 إلى 15 دقيقة ثم قم بإزالة الجنين وجمع EDTA الذي يحتوي على الدم. بعد ذلك ، قم بإزالة السائل السلوي المحيط بالجنين. بعد ذلك ، قم بإزالة الأطراف الخلفية والأطراف الغريبة من الجنين.

باستخدام زوج من الملقط الدقيق ، افتح الصدر. بعد ذلك ، أمسك الجزء الأمامي من القلب واسحب الأنسجة برفق مع تحرير الأعضاء الداخلية من الجسم باستخدام زوج ثان من الملقط. تحت مجهر تشريح ، افصل كبد الجنين عن القلب والأمعاء.

وانقل العضو إلى طبق 24 جيدا مملوء ب 0.5 مل من محلول الهضم. يعد الاتصال التشريحي بنظام القلب والأوعية الدموية أمرا بالغ الأهمية لتحديد كبد الجنين. لا يزال كبد الجنين في هذه المرحلة التنموية وكلما كانت الأجنة أصغر سنا ، زادت صعوبة التشريح.

لتحضير معلقات الخلايا الأولية ، قم باحتضان الأعضاء المجمعة في محلول الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتحميل الأنسجة الموجودة في المحلول الأنزيمي في مصفاة 10 ميكرومتر مثبتة فوق لحام واحد من لوحة زراعة الأنسجة ذات الستة لحام مملوءة ب 1 مليلتر من المخزن المؤقت FACS. استخدم مكبسا مطاطيا أسود من نظام 2 ملم لفصل الأنسجة عن طريق هرسها برفق للحصول على تعليق خلية واحدة.

بعد ذلك ، قم بشفط معلق الخلية باستخدام ماصة باستور ونقله إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 320 مرة G عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بالشفط والتخلص منه.

بعد ذلك ، قم بإعداد مخزن مؤقت جديد لحجب Fc وأعد تعليق الحبيبات في 60 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولترا من تعليق الخلية المفردة إلى بئر من لوح سفلي دائري مكون من 96 بئرا. احتضن الطبق على الثلج لمدة 15 دقيقة على الأقل.

بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولترات المتبقية من المعلق إلى أنبوب FACS من البوليسترين سعة 5 ملليلتر للحصول على مجموعة من العينات المشتقة من أنسجة مختلفة. انقل 50 ميكرولترا من المسبح لأدوات التحكم في FMO لكل فلوروكروم إلى لوحة 96 متعددة الآبار. للمضي قدما في تلطيخ سطح المستضد ، استخدم مجموعة من ستة أجسام مضادة فلورويكروم لتحضير محلول الأجسام المضادة ومخزن FACS.

ثم قم بإعداد ستة محاليل للأجسام المضادة ومخزن FACS المستخدم في تلطيخ التحكم في FMO. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من محاليل الأجسام المضادة إلى العينات الموجودة في لوحة 96 متعددة الآبار. امزج العينات عن طريق سحب العينة المزدوجة اللطيفة ثم احتضان الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة.

قم بالطرد المركزي للوحة 96 متعددة الآبار عند 320 مرة جم عند 4 درجات مئوية لمدة 7 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بتدوير اللوحة مرة أخرى. يجب توخي الحذر بشكل خاص عند إزالة المادة الطافية عن طريق انعكاس اللوحة.

يجب قلب اللوحة متعددة الآبار 96 بحركة معصم حادة واحدة لتجنب فك الخلايا. أخيرا ، باستخدام مصفاة صغيرة 70 ، قم بتصفية الأنسجة وعينات التحكم في أنابيب البوليسترين 6 ملم. يمكن الآن إجراء تحليل التدفق الخلوي.

تم تحليل مجموعة من الخلايا السيتية الحية غير كريات الدم الحمراء المفردة للتعبير عن مجموعة علامات السلف وعلامة الخلايا المكونة للدم CD45. ضمن السكان المستهدفين ، تم تمييز ثلاث مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا. KIT إيجابي CD45 سلبي ، KIT إيجابي CD45 منخفض و KIT سلبي CD45 إيجابي.

من بين الأسلاف الإيجابية لمجموعة كيس الصفار ، احتوت كل من الخلايا السلبية CD45 و CD45 على خلايا موجبة AA4.1 تعبر عن البروتين الفلوري الأصفر أو YFP ، مما يشير إلى أن الأسلاف الإيجابية غير الناضجة KIT تعبر أولا عن AA4.1 بغض النظر عن تعبير CD45. تم العثور على الخلايا الإيجابية AA4.1 الإيجابية في الكبد والدماغ فقط في مجموعة السلف المنخفضة CD45 الإيجابية KIT وتتوافق على الأرجح مع الأسلاف المنتشرة التي نشأت من أسلاف كيس الصفار. تم العثور على البلاعم في مجموعة CD45 سلبية وحددت على أنها خلايا موجبة CD11 B ساطعة F480.

تم تصنيف البلاعم في كيس الصفار والكبد والدماغ بكفاءة من خلال إعطاء 4-هيدروكسي تاموكسيفين واحد قد يشير إلى أصلها في ENP. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء عزل الخلايا وتلطيخها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما الاحتفاظ بالعينات على الجليد بمجرد جمعها.

يجب إعداد مخازن FACS الطازجة يوميا وتصفيتها. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام سلالات الهريس أو سلالات التدفق الأخرى مثل Rosa MTMG أو Rosa Confetti lines للإجابة على أسئلة إضافية حول عدم التمايز وإمكانات المرحلة الأولية للخلايا المسماة بالمنشور.