تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف السلائف المكونة للدم في كيس المح، ونسلها في الجسم الحي باستخدام نظام رسم خرائط المصير في الفئران المستحث بالتاموكسيفين والتدفق الخلوي. يمكن أن يساعد ذلك في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم المناعة تتعلق بتطور وتمايز السلائف المكونة للدم والتي تختلف عن الخلايا الجذعية المكونة للدم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية مراقبة السلائف المكونة للدم التي تم وسمها ضمن نافذة زمنية محدودة، وكذلك مراقبة نسلها مثل البلاعم المقيمة خلال مراحل التطور ومرحلة البلوغ.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب كمية الخلايا في الأنسجة الجنينية والحجم الكبير للعينات التي يتم معالجتها في آن واحد. لبدء التجربة، قم أولاً بنقل قرون الرحم المستأصلة من الفأر إلى طبق بتري مقاس 10 مليمتر مملوء بحوالي 30 مليلتر من PBS بارد جداً. مباشرة بعد ذلك، أمسك بطبقات عضلات الرحم عند الطرف العنقي للقرن ومرر مقصاً دقيقاً بين الطبقة العضلية والنسيج الساقط لتحرير الأجنة.

ثم قم بإزالة غشاء رايخرت (Reichert's membrane) باستخدام ملقط دقيق وأزل المشيمة. قم بتشريح كيس المحّ بلطف وانقله إلى طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً مملوء بـ 0.5 milliliters من محلول الهضم. بعد قطع الأوعية السرة والوريدية، انقل الجنين فوراً إلى طبق زراعة أنسجة مكون من 12 بئراً مملوء بـ 2 milliliters من EDTA بتركيز 10 millimolar مبرد بالثلج.

بعد إزالة الرأس من الجنين باستخدام مقص رفيع وحاد، يتم تحضين الجسم والرأس على الثلج لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة، ثم يُرفع الجنين ويُجمع الـ EDTA المحتوي على الدم. بعد ذلك، تُزال السلى المحيطة بالجنين. وفي الختام، تُزال الأطراف الخلفية والأطراف الغريبة من الجنين.

باستخدام ملقط دقيق، افتح الصدر. بعد ذلك، أمسك بالجزء الأمامي من القلب واسحب الأنسجة برفق أثناء تحرير الأعضاء الداخلية من الجسم باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط. وتحت مجهر تشريحي، افصل كبد الجنين عن القلب والأمعاء.

ثم انقل العضو إلى طبق يحتوي على 24 بئراً مملوءة بـ 0.5 milliliters من محلول الهضم. يعد الاتصال التشريحي بالجهاز القلبي الوعائي أمراً بالغ الأهمية لتحديد الكبد الجنيني. لا يزال الكبد الجنيني في هذه المرحلة التطورية، وكلما كانت الأجنة أصغر سناً، زادت صعوبة عملية التشريح.

لتحضير معلقات الخلايا الأولية، يتم تحضين الأعضاء المجمعة في محلول الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم وضع النسيج الموجود في المحلول الإنزيمي في مصفاة 10 ميكرومتر مثبتة فوق إحدى فجوات طبق زراعة أنسجة سداسي الفجوات المملوء بـ 1 ملليلتر من FACS buffer. استخدم مكبسًا مطاطيًا أسود من سرنجة 2 مليمتر لتفكيك النسيج عن طريق الهرس اللطيف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.

بعد ذلك، اسحب معلق الخلايا باستخدام ماصة باستور وانقله إلى أنبوب سعة 15 milliliter. قم بطرد مركزي للمعلق عند 320 ×g في درجة حرارة 4 degrees Celsius لمدة 7 دقائق. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي وتخلص منه.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول منظم لحجب Fc طازج وأعد تعليق الراسب في 60 microliters. ثم، انقل 50 microliters من معلق الخلايا المفردة إلى بئر في طبق ذي قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً. احضن الطبق على الثلج لمدة 15 minutes على الأقل.

بعد ذلك، انقل الـ 10 µL المتبقية من المعلق إلى أنبوب FACS بولي ستيرين سعة 5 mL للحصول على تجمع من العينات المستمدة من أنسجة مختلفة. انقل 50 µL من هذا التجمع إلى لوحة 96 بئراً متعددة لاستخدامها كعناصر تحكم FMO لكل فلوروكروم. وللمتابعة في صبغ السطح المستضدي، استخدم مجموعة من ستة أجسام مضادة مرتبطة بفلوروكرومات لتحضير محلول الأجسام المضادة ومحلول FACS المنظم.

بعد ذلك، قم بتحضير ستة محلول للأجسام المضادة ومحلول FACS المنظم المستخدم في صبغ تحكم FMO. بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول الأجسام المضادة إلى العينات الموجودة في طبق متعدد الآبار سعة 96 بئراً. اخلط العينات عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة مرتين، ثم قم بتحضين الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة.

قم بطرد مركزي لصفيحة الـ 96 بئرًا عند 320 ×g وبدرجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 7 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي. اغسل الخلايا باستخدام 200 µL من محلول FACS المنظم، وقم بطرد مركزي للصفيحة مرة أخرى. يجب توخي الحذر الشديد عند إزالة السائل الطافي عن طريق قلب الصفيحة.

يجب قلب الصفيحة ذات الـ 96 بئراً بحركة سريعة واحدة من المعصم لتجنب تخلخل الخلايا. وأخيراً، باستخدام مصفاة دقيقة بمسامية 70 µm، يتم ترشيح عينات الأنسجة وعينات التحكم في أنابيب بولي ستيرين سعة 6 mm. ويمكن الآن إجراء تحليل التدفق الخلوي.

تم تحليل مجموعة من الخلايا الأحادية الحية غير الكروية لتحليل تعبير واسم الخلايا السلفية KIT وواسم الخلايا المكونة للدم CD45. وفي غضون المجموعة المستهدفة، تم تمييز ثلاث مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا: KIT إيجابية وCD45 سلبية، وKIT إيجابية وCD45 منخفضة، وKIT سلبية وCD45 إيجابية.

من بين أسلاف KIT الموجبة في كيس المح، احتوت كل من المجموعات الخلوية السالبة لـ CD45 والمنخفضة لـ CD45 على خلايا موجبة لـ AA4.1 تعبر عن البروتين الفلوري الأصفر أو YFP، مما يشير إلى أن الأسلاف غير الناضجة الموجبة لـ KIT تعبر أولاً عن AA4.1 بغض النظر عن تعبير CD45. أما الخلايا الموجبة لـ AA4.1 والموجبة لـ YFP في الكبد والدماغ فقد وجدت فقط في مجموعة الأسلاف الموجبة لـ KIT والمنخفضة لـ CD45، وهي تتوافق على الأرجح مع الأسلاف الجائلة التي نشأت من أسلاف كيس المح. وقد وجدت البلاعم في المجموعة السالبة لـ KIT والموجبة لـ CD45، وتم تحديدها على أنها خلايا موجبة لـ CD11 B وذات تعبير ساطع لـ F480.

تم وسم الخلايا البلعمية في كيس المح، والكبد، والدماغ بكفاءة من خلال إعطاء جرعة واحدة من 4-hydroxy tamoxifen، مما قد يشير إلى أصلها من الخلايا السلفية العصبية (ENP). وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إتمام إجراء عزل الخلايا وصبغها في غضون ثلاث إلى أربع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ دائمًا على العينات مبردة على الثلج فور جمعها.

يجب تحضير محاليل FACS المنظمة الطازجة يومياً وترشيحها. وباتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام سلالات مراسلة أو سلالات تدفق أخرى مثل خطوط Rosa MTMG أو Rosa confetti بهدف الإجابة على أسئلة إضافية حول إمكانات مرحلة البروتو (proto phase) وإلغاء التمايز للخلايا التي تم وسمها لاحقاً.