باستخدام الثقافات Neurosphere الأولية لدراسة الابتدائية سيليا

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طرق الاستزراع القائمة على الغلاف العصبي للخلايا الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلفية لدراسة التكوين الحيوي للأهداب الأولية والاتجار بها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأهداب الأولية مثل التكوين الحيوي للأهداب وتهريب جزيئات الأهداب إلى الأهداب الأولية. في الخلايا الجذعية العصبية الأولية والأسلاف العصبية والخلايا العصبية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا استخدام معايير الخلية الأولية للخلايا الجذعية العصبية والأسلاف العصبية والخلايا العصبية لتحليل التكوين الحيوي والمسارات الهدبية في سياق الأهداب الأولية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن زراعة الخلايا الجذعية العصبية يمثل تحديا تقنيا للمبتدئين. سنوضح أن عرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية ، حيث يمكن بسهولة تعلم تشريح البطين الجانبي وخطوات مثل زراعة المجالات العصبية والقياس الكمي للأهداب الأولية من خلال مراقبة الخطوات الحرجة.

ابدأ هذا الإجراء بمنطقة تحت البطينية من البطين الجانبي تم تشريحها من فأر بالغ باستخدام طريقة تشريح التركيب بالكامل. ضع الأنسجة التي تحتوي على SVZ في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA في PBS واحتضن 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.

بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من وسيط التوقف والماصة برفق 20 إلى 30 مرة باستخدام طرف 1 ملليلتر. تجنب تكوين فقاعات الهواء أثناء سحب العينات. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 500 مرة G لمدة ثماني دقائق.

تخلص من المادة الطافية ثم أضف 1 ملليلتر من PBS وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة برفق خمس مرات باستخدام طرف 1 ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 500 مرة G لمدة ثماني دقائق. ثم استنشق الوسط باستخدام طرف 1 مليلتر وأضف 1 مليلتر من الوسط القاعدي.

بعد عد الخلايا ، قم بوضع الخلايا من VZ واحد في طبق 10 سم مع 10 ملليلتر من وسط NSC وزراعته عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد خمسة إلى سبعة أيام ، يمكن ملاحظة المجالات العصبية. لتحليل الخلايا في المجالات العصبية المتصلة عن طريق التلوين المناعي ، انقل 1 مليلتر من الوسط الذي يحتوي على مجالات عصبية متعددة إلى أنبوب 1.5 مليلتر وقم بالدوران عند 500 مرة G لمدة ثماني دقائق.

بعد إزالة الوسيط ، قم بإصلاح الكرات بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 15 دقيقة. بعد إزالة بارافورمالدهايد ، احتضان الكرات بنسبة 30٪ من السكروز بين عشية وضحاها. ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى.

يغسل مع PBS. ثم ، بعد الطرد المركزي كما كان من قبل ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. بعد ذلك، ضع ماصة بطرف مقطوع سعة 1 مليلتر وماصة 500 ميكرولتر من محلول OCT على المجالات العصبية.

انقل محلول OCT الذي يحتوي على المجالات العصبية إلى قالب تجميد بلاستيكي يمكن التخلص منه. ثم قم بتجميد القالب على الثلج الجاف لمدة 15 دقيقة على الأقل. قطع الأقسام باستخدام cryostat.

لتصور الخلايا الجذعية في الغلاف العصبي ، قم بإجراء تلبوخية مناعية ضد علامة الخلايا الجذعية Nestin. لتصور الأهداب الأولية في الغلاف العصبي ، قم بإجراء تلبوخية مناعية ضد ARL13B. ابدأ هذه التجربة بعد يوم إلى يومين من زرع الخلايا الجذعية العصبية المنفصلة الملتصقة على زلات الغطاء المطلية ب Poly-L-Lysine و Laminin.

قم بتغيير الوسط في الآبار التجريبية إلى وسط تجويع ، وإلى وسط NSC جديد في آبار التحكم. احتضن لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم التالي ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد التثبيت ، اغسل باستخدام PBS مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما ، في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإجراء التآكل المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية. قم بتركيب زلات الغطاء بمحلول تثبيت.

ثم جفف الزجاج المنزلق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في اليوم التالي ، احصل على صور على مجهر مركب بالتكبير اللازم. يجب التحكم في كاميرا المجهر وأهدافها باستخدام البرنامج المصاحب.

خذ أقساما كافية من المقاطع النصية على فترات تتراوح من 0.5 إلى 0.8 ميكرون. للتحليل الكمي للتوطين الهدبي في الخلايا الملتصقة ، حدد ثلاثة إلى ثمانية حقول متتالية مع خلايا ملتصقة من خلال عرض قناة DAPI. احصل على مجموعات من الصور من كل حقل.

حدد عدد الأهداب الأولية باستخدام ImageJ. افتح مربع الحوار تحليل المكونات الإضافية وحدد أداة عداد الخلايا لحساب الخلايا ذات الأهداب الموجبة ل GPCR. استخدم معلمات كثافة الصورة والتباين المتشابهة لجميع الصور من نفس التجربة لأغراض العد والتصدير.

بعد 24 ساعة من زراعة الخلايا المنفصلة في وسط NSC أو وسط الجوع ، تم تثبيت الخلايا وتلطيخها بالمناعة ضد GPR161 الموضح باللون الأخضر ، و ARL13B الذي يظهر باللون الأحمر ، ويظهر الحمض النووي باللون الأزرق. لوحظت الأهداب الإيجابية GPR161 في خلايا التحكم على اليسار ، والخلايا الجائعة على اليمين. كما رأينا في هذه الآراء الموسعة.

تشير الأسهم البيضاء ورؤوس الأسهم إلى أهداب GPR161 موجبة وسالبة ، على التوالي. توضح هذه الصورة القياس الكمي للخلايا المهدبة الإيجابية ARL13B. يتم إجراء القياس الكمي من مجالين للرؤية كل منهما من نسختين مكررتين تقنيتين لتجربة واحدة.

تزداد النسبة المئوية للخلايا المهدبة الإيجابية ARL13B عند الجوع. توضح هذه الصورة القياس الكمي لتوطين GPR161 في أهداب ARL13B الإيجابية في الخلايا الضابطة والجائعة. تزداد أيضا النسبة المئوية لتوطين GPR161 في الأهداب الإيجابية ARL13B عند الجوع.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى لزراعة الخلايا الأولية المشتقة من الورم من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل دور الأهداب في تكوين الورم. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأهداب الأولية لاستكشاف التكوين الحيوي الهدبي والاتجار في الأنظمة القائمة على الغلاف العصبي الأولية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل الأهداب الأولية في الخلايا الجذعية العصبية والأسلاف العصبية والخلايا العصبية المشتقة من الثقافات القائمة على الغلاف العصبي.