التحجيم من المهندسة الطعوم الأوعية الدموية عن طريق 3D مطبوعة أدلة والطوق زرع الطريقة

الهدف العام من هذه الطريقة هو توليد أوعية دموية هندسية بقوة وباستمرار من أي حجم. تسمح هذه التقنية بهندسة موثوقة وفعالة للأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصنيع السفن من أي حجم بسهولة وموثوقية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نناقش كيفية هندسة أنبوب من الأنسجة وشبهنا طريقتنا ببناء أنفاق الطرق ، قطعة واحدة في كل مرة. لتحضير الإدخالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، أضف أولا طبقة رقيقة من اثنين أو أربعة أو ستة مل من السيليكون غير المعالج إلى قيعان طبق بتري 35 أو 60 أو 100 ملم ، على التوالي. لإنشاء أعمدة لألواح 35 مم ، اسكب PDMS في لوحة مختلفة مقاس 100 مم بارتفاع سبعة مم ، وقم بتسخين PDMS على لوح تسخين عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.

عندما يتم علاج PDMS ، استخدم ثقب خزعة بخمسة مم لإنشاء أعمدة أسطوانية. استخدام كمية صغيرة من PDMS غير المعالج لتأمين الأسطوانات في وسط كل لوحة مقاس 35 مم. ضع غلافا خارجيا مطبوعا ثلاثي الأبعاد يبلغ قطره حوالي 66.7 مم على مسافة متساوية من العمود في الألواح مقاس 100 مم.

قبل معالجة PDMS في الجزء السفلي من الألواح 60 و 100 مم ، ضع أعمدة مطبوعة ثلاثية الأبعاد بقطر 10 و 20 مم مركزيا في كل لوحة 60 و 100 مم على التوالي. اسمح للأطباق بالمعالجة في الهواء الطلق على لوح تسخين 60 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات ، تليها ثمانية عشر ساعة من تفريغ البوليمر. في نهاية التفريغ ، قم بتعقيم الدواخل من جميع الألواح بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتغطية كل لوحة لمدة 30 دقيقة.

ثم قم بشفط الإيثانول بعناية من كل لوحة للسماح بالتجفيف بالهواء. عندما تجف الألواح ، انقلها إلى خزانة أمان بيولوجية بجوار الأغطية المقابلة لأعلى. وتعريض المواد للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لإكمال التعقيم.

لتحضير هيدروجيل الفيبرين ، أضف أولا 0.5 و 1.1 و 1.81 مل من وسط النمو المكمل بهلام الفيبرين و TGF Beta 1 إلى 35 و 60 و 100 مم على التوالي. بعد ذلك ، أضف 40 88.4 و 145 ميكرولترا من الثرومبين إلى الألواح 35 و 60 و 100 مم على التوالي ، وقم بتدوير كل لوحة يدويا برفق. عندما يتم توزيع الثرومبين بالتساوي ، أضف 160 و 354 و 580 ميكرولتر من الفيبرينوجين بحركة دائرية قطرية إلى خليط الثرومبين المتوسط في الألواح 35 و 60 و 100 مم ، على التوالي ، وقم بتدوير الألواح برفق لتوزيع الهيدروجيل بالتساوي.

اترك الهيدروجيل يجف لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بالتربسين بخلايا العضلات الملساء ذات الأهمية ، وتوسيعها في ألواح زراعة الخلايا 150 مم ، وجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الكريات في ثلاثة مل من وسط التمايز واستخدم ماصة مللي لإخراج الخلايا بقوة لتفتيت أي كتل خلايا.

بعد العد ، قسم الخلايا إلى 2/10 10 إلى 6 ، و 1/10 10 إلى 7 ، و 1.4 × 10 إلى الخلايا السابعة لكل مل من الحصص في أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، مصنفة وفقا للوحات الثقافة المقابلة لها. أضف وسيط التمايز إلى كل أنبوب للحصول على أحجام بذر نهائية من اثنين وأربعة وخمسة مل لكل لوحة 35 و 60 و 100 مم على التوالي بعد ذلك ، أضف محاليل الخلية بعناية إلى الهيدروجيل المحضر في كل لوحة مقابلة للتوسع في حاضنة زراعة الخلايا. بعد يومين إلى أربعة أيام ، ستكون الحلقات قد انكمشت تماما نحو وظائفها.

لذا أضف 10 أو 20 أو 35 مل من TGF Beta 1 إلى كل حلقة 35 و 60 و 100 مم ، على التوالي. لتجميع هيكل الأوعية الدموية للوعاء مقاس 35 مم ، قم بقطع قسم بوصتين من أعلى 50 مل من أنبوب مخروطي من البولي كربونات ، وقم بلصق الحافة العلوية في صفيحة 35 مم لإنشاء صفيحة طويلة لتكديس الحلقة. بالنسبة لألواح التكديس الحلقية الطويلة للوعاء مقاس 60 و 100 مم ، تقطع أنبوب بولي كربونات بقطر 1.75 بوصة إلى أقسام طولها 2.5 بوصة لتكون بمثابة جدران الألواح الطويلة.

بالنسبة لقيعان الألواح الطويلة ، قم بتقطيع لوح بولي كربونات بسمك 0.125 بوصة إلى قطع دائرية قطرها بوصتين. باستخدام الأسمنت المذيب الأكريليكي ، قم بربط أقسام أنبوب البولي كربونات بالقطع المقطوعة الدائرية. طباعة ثلاثية الأبعاد خمسة وعشرة وأعمدة قطرها 20 مم بطول 50 مم.

ثم أضف 10 مل من السيليكون غير المعالج إلى كل حاوية ، مع وضع كل عمود مطبوع ثلاثي الأبعاد مركزيا في كل حاوية 35 و 60 و 100 مم قبل معالجة PDMS تماما. ووضع الأطباق على لوح تسخين 60 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. عندما يتم علاج PDMS ، قم بتعقيم الألواح بنسبة 70٪ من الإيثانول كما هو موضح للتو ، متبوعا بتعرض حاويات الإيثانول المجففة المعقمة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.

الآن ، استخدم زوجين من الملقط الدقيق جدا لرفع الجانب الأول بعناية ، ثم الآخر ، من حلقة هيدروجيل عضلية ملساء ملفوفة بإحكام من عمودها. ثم حرك جانبا واحدا من الحلقة بعناية ثم الآخر على العمود الطويل للحاوية الأكبر ذات الحجم التالي. العمل بشكل محيطي ، بحركات تدريجية لطيفة ، ادفع الحلقة ببطء لأسفل العمود ، ثم قم بتكديس حلقات الأنسجة الإضافية حتى يتم الحصول على طول الوعاء المطلوب.

عندما يتم تكديس جميع الحلقات ، قم بتدوير الألواح بحيث تكون الأعمدة موازية لسطح العمل ، وأضف برفق 40 و 80 و 160 ميكرولترا من الثرومبين إلى السطح الخارجي لكل وعاء 35 و 60 و 100 مم على التوالي أثناء تدوير الألواح ببطء. بعد ذلك ، أضف 40 و 80 و 160 ميكرولترا من الفيبرينوجين إلى كل بنية 35 و 60 و 100 مم على التوالي ، بأسرع ما يمكن وبشكل متساو أثناء تدوير الهيكل بسرعة. سيتم وضع الثرومبين والفيبرينوجين بسرعة في هلام صلب عند الخلط.

ثم أضف 20 مل من وسط التمايز إلى كل حاوية بناء وضع الأوعية في حاضنة 37 درجة مئوية لحين الحاجة. يكشف التحليل النسيجي عن خلوية عالية في جميع الأحجام الحلقية ، مع ملاحظة كمية صغيرة من هلام الفيبرين المتبقي على الحواف الخارجية للحلقات الصغيرة. في الحلقات الكبيرة ، يتخلل بعض هلام الفيبرين المحتوى الخلوي ، مع مؤشرات على إنتاج الكولاجين الواضحة في كل من الحلقات المتوسطة والكبيرة.

يكشف تحليل حلقة الأنسجة لتعبير Alpha Smooth Actin و Tropomyosin أن جميع أحجام الحلقات إيجابية لكلا الأجسام المضادة ، مما يتحقق من الحفاظ على النمط الظاهري للعضلات الملساء. يشير اختبار الشد إلى اتجاه ثابت لزيادة القوة المرتبطة بزيادة حجم الحلقة والوعاء في جميع أحجام الحلقات الثلاثة. ترتبط أرقام بذر الخلايا لإنشاء أحجام الحلقات المختلفة أيضا بمساحة سطح البذر.

تركيبات الأوعية هذه قادرة على تحمل التدفق لمدة تصل إلى خمس دقائق بمعدلات تدفق تتراوح من 100 إلى 417 مل في الدقيقة مع ملاحظة تسرب طفيف فقط حيث تتصل الأوعية بنظام الوفرة. بمجرد إتقانها ، يمكن هندسة الحلقات في ساعة واحدة إذا تم تنفيذ التقنية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خلط مكونات الهيدروجيل جيدا لضمان ضبط الجل وتكوين الحلقة بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل إنشاء حلقات من أنواع الخلايا الأخرى ، لهندسة أنواع أخرى من الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام طريقة تكديس الحلقة لهندسة أنسجة الأوعية الدموية بأحجام مختلفة.