مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

العام لمقايسة HS-MRM هو تقليل ظاهرة تداخل MRM التي تؤثر على القياس الكمي للببتيد أو البروتين من خلال الجمع بين فصل حركة الأيونات لسلائف الببتيد والكشف الطيفي الكتلي عالي الدقة لأيونات الشظايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توصيف العلاج الحيوي بالإضافة إلى القياس الكمي للبروتين أو الببتيد للمؤشرات الحيوية والبروتينات الكمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالكشف عن بروتينات الخلية المضيفة منخفضة الوفرة التي قد تكون موجودة في البروتينات الصيدلانية الحيوية.

أولا ، انقر فوق إنشاء طريقة تحليل في برنامج الحصول على البيانات واختر طريقة الإنشاء والاكتساب والمعالجة. اكتب اسم الطريقة ووصفها، واستعرض وصولا إلى مجلد الأسلوب وانقر فوق التالي. بالنسبة لنوع التحليل، أختر IMS لخريطة الببتيد وانقر فوق التالي.

ثم حدد تكوين النظام الحالي وانقر فوق التالي والإنهاء. في الطريقة التي تم إنشاؤها حديثا ، انقر فوق علامة التبويب الأدوات ، وحدد مدير المذيبات الثنائية ، وقم بتحرير إعدادات التدرج لتحقيق فصل الببتيد بمعدل تدفق 0.2 مل في الدقيقة. استخدم تخفيف التدرج من واحد إلى 40٪ مذيب B في 30 دقيقة متبوعا بغسل عمود لمدة دقيقتين وتوازن لمدة 10 دقائق مع وقت تشغيل إجمالي يبلغ 45 دقيقة.

بعد ذلك ، حدد مدير العينة واضبط درجة حرارة العينة على 10 درجات مئوية ودرجة حرارة العمود على 60 درجة مئوية. في علامة التبويب الأدوات، حدد أداة Vion IMS QTof. في قسم الإعدادات ، حدد الحساسية لوضع المحلل وأدخل ثلاثة كيلو فولت للجهد الشعري ، و 100 درجة مئوية لدرجة حرارة المصدر ، و 250 درجة مئوية لدرجة حرارة التلف ، و 50 لترا في الساعة لتدفق الغاز المخروطي ، و 500 لتر في الساعة لتدفق غاز الانهيار.

انقر فوق علامة تبويب التجربة وحدد MSE عالي الدقة للوضع. ثم أدخل 100 للكتلة المنخفضة ، و 2000 للكتلة العالية ، و 0.4 ثانية لوقت المسح. في قسم طاقة الاصطدام ، اكتب ستة إلكترون فولت لإعداد الطاقة المنخفضة واختر منحدرا عالي الطاقة من 15 إلى 40 إلكترون فولت.

بالنسبة لوقت الاكتساب، استخدم وقت تشغيل مخصص يتراوح بين خمس و30 دقيقة. بعد ذلك ، انقر فوق علامة تبويب الخيارات وحدد وضع تصحيح القفل التلقائي بفاصل زمني لتصحيح القفل التلقائي لمدة خمس دقائق. ثم حدد خيار المتابعة مع تصحيح القفل وللتأكد من تعطيل فحص الكاشف التلقائي.

في قائمة تكوين النظام الحالية ، حدد أداة Vion IMS QTof وانقر فوق الأدوات. أدخل ثلاثة كيلو فولت للجهد الشعري ، و 40 فولت لأخذ العينات ، و 100 فولت لإزاحة المصدر ، و 100 درجة مئوية لدرجة حرارة المصدر ، و 250 درجة مئوية لدرجة حرارة التلف ، و 50 لترا في الساعة لتدفق الغاز المخروطي ، و 500 لتر في الساعة لتدفق غاز الخراب ، وثلاثة كيلو فولت للجهد الشعري المرجعي. قم بتحليل عينة مسننة مسننة 10 نانومولار معدة مسبقا باستخدام مقايسة LC-HDMSE الموصوفة للتو عن طريق حقن 10 ميكرولتر من العينة في الجهاز.

عرض التسلسلات الفردية لستة معايير لببتيد الفوسفوريل B الموجودة في خليط الببتيد الصناعي هنا جنبا إلى جنب مع أوقات الاحتفاظ بها وسلائفها الأكثر وفرة التي لوحظت في تجربة HDMSE. يتم عرض أطياف HDMSE المكتسبة لأحد الببتيدات المزيفة المتراكمة في ملخص Infliximab هنا. في برنامج الحصول على البيانات ، انقر فوق إنشاء طريقة التحليل واختر طريقة الإنشاء والاكتساب والمعالجة.

اكتب اسم الطريقة ووصفها، واستعرض وصولا إلى مجلد الأسلوب وانقر فوق التالي. لنوع التحليل ، اختر القياس الكمي ، وحدد Quantify Assay Tof 2D Chromatographic وانقر فوق التالي. ثم حدد تكوين النظام الحالي وانقر فوق التالي والإنهاء.

انقر فوق علامة تبويب الأدوات في الطريقة التي تم إنشاؤها حديثا. حدد مدير المذيبات الثنائية وقم بتحرير إعدادات التدرج لتحقيق فصل الببتيد بمعدل تدفق 0.2 مل في الدقيقة. استخدم تخفيف التدرج من مذيب واحد إلى 40٪ مذيب B في 30 دقيقة متبوعا بغسل عمود لمدة دقيقتين وتوازن لمدة 10 دقائق مع وقت تشغيل إجمالي يبلغ 45 دقيقة.

في علامة التبويب الأدوات، حدد مدير العينة واضبط درجة حرارة العينة على 10 درجات مئوية ودرجة حرارة العمود على 60 درجة مئوية. حدد الآن أداة Vion IMS QTof وفي قسم الإعدادات ، حدد الحساسية لوضع المحلل. ثم أدخل ثلاثة كيلو فولت للجهد الشعري ، و 100 درجة مئوية لدرجة حرارة المصدر ، و 250 درجة مئوية لدرجة حرارة التلف ، و 50 لترا في الساعة لتدفق الغاز المخروطي ، و 500 لتر في الساعة لتدفق غاز الهلاك.

انقر فوق علامة تبويب التجربة وبالنسبة لنوع التجربة ، اختر جدول الوظائف وظيفة واحدة أو أكثر من وظائف MS أو MSMS أو MRM. احذف وظيفة الاستحواذ الافتراضية ، وانقر فوق إضافة بالإضافة إلى MRM ، وقم بتحرير معلمات نافذة الاستبقاء في قسم وقت التشغيل. في محرر دالة Tof MRM، أدخل نسبة الشحن الرئيسية لسلائف الببتيد، وحدد منخفضا لدقة السلائف، وأدخل حالة شحن السلائف.

ثم أدخل نسبة الشحن الرئيسية للمنتج 16 إلكترون فولت لطاقة الاصطدام البدائية ، و 0.1 ثانية لوقت المسح الثابت ، وواسعة لعمود الطيف. باستخدام الزر المكرر ، أضف 10 انتقالات MRM أخرى واستخدم قيم طاقة تصادم مختلفة في حدود 18 إلى 36 إلكترون فولت. بعد تحديد أفضل ثلاثة انتقالات لكل ببتيد ، تم إجراء تجربة Tof MRM للعثور على طاقة الاصطدام المثلى لتعظيم الإشارات المتولدة لكل ببتيد.

بعد ذلك ، قم بإعداد طريقة HS-MRM التي تحتوي على أيون جزء واحد فقط لكل ببتيد. قم بتعديل طريقة Tof MRM التي تم إنشاؤها مسبقا عن طريق تحديد الدالة HS-MRM بدلا من الدالة Tof MRM. في محرر وظائف HS-MRM، أدخل نسبة الشحن الرئيسية، وحدد منخفضا لدقة السلائف، وأدخل حالة شحن السلائف.

ثم أدخل قيمة CCS السلائف وحدد منخفضا لدقة CCS السلائف. بالنسبة لأيون المنتج ، أدخل نسبة الشحن الرئيسية الخاصة به ، وحدد طاقة الاصطدام المثلى ، واختر وقت مسح يبلغ 0.4 ثانية ، وحدد إعداد طيف واسع لتضمين جميع نظائره. يحتفظ اختبار HS-MRM النهائي فقط بأفضل انتقال لكل ببتيد ويستخدم لتحليل جميع العينات المسننة.

في طريقة التحليل التي تم إنشاؤها لطريقة الحصول على بيانات HS-MRM، انقر فوق علامة تبويب الغرض واختر إدارة المكونات. من القائمة المنسدلة ضمن نوع التجربة، حدد خيار HS MSMS/HS MRM. انقر فوق إنشاء وأدخل اسم المكون ووقت الاستبقاء المتوقع ونافذة وقت الاستخراج ونسبة الشحن الرئيسية للسلائف.

حدد وضع استخراج XIC واكتب قيمة CCS المتوقعة. بالنسبة لأيون الشظية ، أدخل حالة الشحن ونسبة الشحن الرئيسية. ثم أدخل جميع مكونات الببتيد التي تتم مراقبتها بواسطة مقايسة HS-MRM.

في علامة تبويب الغرض لطريقة اكتساب HS-MRM نفسها ، انقر فوق المبالغ الافتراضية وأدخل 0.1 و واحد و 10 و 100 نانومولار لجميع مكونات الببتيد الصناعي. بعد إدخال القيمة الأولى ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد خيار التعبئة لأسفل لإدخال نفس التركيز لجميع المكونات. كرر نفس الإجراء لجميع التركيزات الأربعة لمنحنى المعايرة.

انتقل الآن إلى علامة تبويب المعالجة وانقر على إعدادات الاستخراج. إدخال 10 جزء في المليون لتحمل الكتلة. ثم انقر فوق تحمل وقت الانجراف CCS وإدخال 5٪ لتحمل CCS.

في علامة التبويب المعالجة، حدد إعدادات ذروة المعالجة. في القسم السلس ، حدد المتوسط كخوارزمية التنعيم ، وواحد كنصف العرض ، والآخر كتكرارات. في قسم التكامل، تأكد من تحديد كل من عرض الذروة التلقائي وخيارات الكشف التلقائي.

بعد ذلك ، حدد إعدادات الشاشة المستهدفة في علامة تبويب المعالجة وحدد الخيار الأقرب إلى RT في نافذة RT. ثم أدخل 0.2 دقيقة لتحمل وقت الاحتفاظ. حدد إعدادات الكمية وفي قائمة المعايرة، اختر خطيا لنوع ملاءمة منحنى المعايرة، وواحد على x تربيع لنوع الوزن، والتركيز لنوع قيمة المكون، والمليمول لكل لتر لوحدات قيمة المكونات، ولا شيء لحساب نقاط المعايرة عن طريق حساب المتوسط.

في قائمة القياس الكمي، حدد المنطقة كقيمة استجابة. يتم عرض أمثلة على كروماتوجرامات HS-MRM التي تم إنشاؤها للببتيدات المزيفة عبر جميع التركيزات هنا. يتم عرض منحنيات المعايرة التي تم الحصول عليها لكل ببتيد بعد تكامل قمم HS-MRM هنا.

تلخيص الانحراف المعياري النسبي لمنطقة الذروة المحسوبة بناء على أربعة حقن مكررة هنا. نظرا لأن مقايسة MRM عالية الانتقائية تشتمل على فصل سلائف الحركة الأيونية والكشف الطيفي الكتلي المستهدف عالي الدقة ، فإن لديه إمكانات كبيرة ليصبح مقايسة مراقبة سريعة وعالية الإنتاجية لبروتينات الخلايا المضيفة المتعددة عبر دفعات من المستحضرات الصيدلانية الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد اختبار MRM عالي الانتقائية على أداة Vion IMS QTof.