غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

الهدف العام لنظام التصوير هذا هو استخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر لمراقبة تطور الأعضاء النباتية على مدى عدة أيام بدقة دون الخلوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تشكل النبات ، مثل كيف تنسق خلايا الكائنات متعددة الخلايا أنماط نموها وتكاثرها أثناء تكوين الأعضاء؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الإعداد ولا تعتمد على المعدات المتخصصة التي غالبا ما تستخدم في التصوير بفاصل زمني ، مثل أنظمة الوفرة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا المنشور الذي كتبه Littlejohn and Love ، في New Phytologist الذي يصف مزايا البيرفلوروديكالين للتصوير داخل أنسجة الأوراق. للبدء ، استخدم قاطع زجاج لعمل شرائط زجاجية بعرض ثلاثة ملليمترات من شريحة بسمك ملليمتر واحد. بعد ذلك ، باستخدام غراء cyanoacrylate أو شريط مزدوج الجوانب ، قم بتأمين الشرائط على بعد 45 ملم تقريبا عبر عرض شريحة جديدة.

اصنع شريحة إضافية بنفس الأبعاد لتكون بمثابة قالب. الآن ، اصنع حشية بنفس الارتفاع من صمغ PDMS النفاذية للغاز. بلل شريحة ثانية بقليل من الإيثانول المطلق وافرد PDMS على الشريحة إلى ارتفاع الشرائط الزجاجية.

بعد ذلك ، بلل الشفرة بالإيثانول المطلق وقم بقص أي PDMS زائد. هذا أمر بالغ الأهمية لأن الأدوات المبللة بالإيثانول لن تلتصق ب PDMS. بعد ذلك ، أعد تسطيح PDMS حتى ارتفاع الشريط.

بعد ذلك ، قم بقطع تجويف في PDMS الذي سيحتوي على الشتلات وبلاطة أجار. لإنتاج حجم تجويف ثابت ، نستخدم قاطعا محليا مخصصا مصنوعا من perspecs ولكن يمكن استخدام شفرة حلاقة بدلا من ذلك. بعد ذلك ، قم بقص حول الحافة الخارجية لجعل الحشية حوالي ملليمترين.

الآن ، على شريحة بدون حشية PDMS ، ضع غطاء على كلا الشريطين الزجاجيين. ثم في الفراغ الموجود أسفل الغطاء ، قم بوضع الماصة حوالي ملليلتر واحد من وسط أجار المسال الدافئ بما يكفي لملء الفراغ. يمكن أن يحتوي الأجار على مركبات تجريبية ذات أهمية.

بعد ذلك ، قم الهواء بموازنة بعض PFD عن طريق هز حجم صغير من PFD في أنبوب. بمجرد ضبط الأجار ، قم بتحميل ما يقرب من 200 ميكرولتر من PFD في حشية PDMS ، لكن لا تملأها بالكامل. قم بإزالة الغطاء من لوح أجار ، وقم بتقطيعه إلى شكل يناسب بئر حشية جل PDMS.

اترك فجوة من اثنين إلى أربعة ملليمترات بين الأجار وجدار الحشية. بعد ذلك ، املأ الغرفة بالكامل ب PFD متوازن الهواء. لتصوير الجذور الأولية الجاذبية ، يتم استخدام غشاء السليلوز كحاجز مادي على سطح لوح أجار.

يجب أن تكون لوح الأجار أيضا أكثر نعومة مع 0.8٪ أجار بدلا من 1.5٪ أجار. قطع قطعة من الغشاء لها نفس أبعاد كتلة أجار تقريبا. ثم قم بتعقيمه بنسبة 80٪ من الإيثانول واتركه حتى يجف في الهواء.

بمجرد أن يجف ، انقع الغشاء في وسط نمو السائل ثم انقله إلى سطح الأجار. للبدء ، ضع بعناية ما يصل إلى ثلاث شتلات على الأجار. مواقعهم أمر بالغ الأهمية.

يجب أن تتدلى الفلقات والهيبوكتيل فوق حافة الأجار ، وتطفو في PFD. يجب توفير مساحة بين الشتلات للسماح بالنمو. يمكن تجعيد الشتلات إذا كانت كبيرة جدا بحيث لا تتناسب مع الغرفة.

بعد ذلك ، أغلق الغرفة باستخدام غطاء بسماكة تتناسب مع الهدف المختار. اضغط برفق على طول الحافة حتى يتم ملامسة الشرائط الزجاجية. استخدم شريحة زجاجية أخرى للضغط برفق على الغطاء بحيث يستقر بالتساوي على الشريطين الزجاجيين.

بعد ذلك ، قم بتأمين الغطاء باستخدام شريط جراحي صغير مجسم مقطوع إلى نصفين بالطول. الآن ، اسمح للعينة بالاستقرار لمدة نصف ساعة تقريبا قبل التصوير. لتحضير شتلات arabidopsis thaliana للغرف ، قم أولا بتعقيم البذور بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ثم زرعها على وسط مكمل. قم بتقسيم البذور المزروعة إلى طبقات لمدة يومين أو أربعة أيام عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، انقل البذور المزروعة إلى 22 درجة مئوية ، وقم بزراعتها رأسيا تحت دورة إضاءة يومية مدتها 16 ساعة.

لتصوير الجذور الجانبية ، قم بزراعة النباتات لمدة سبعة إلى 10 أيام ثم انقلها إلى غرف التصوير. تم توثيق الجذور الجانبية التي تنمو بمعدلات فسيولوجية في غرف التصوير كل نصف ساعة. نمت الجذور الجانبية أيضا على ألواح بتري القياسية في نفس الوسط للمقارنة.

اختلف معدل نمو الجذور الفردية كثيرا في كلا الإعدادين ، لكن النطاق كان متشابها في أي من الحالتين. بشكل عام ، زاد معدل النمو مع الطول. كان معدل نمو النباتات في غرف التصوير أو على الصفائح لا يمكن تمييزه خلال ال 27 ساعة الأولى من النمو.

بدأت كلتا المجموعتين بنفس متوسط طول الجذر الجانبي. تم تصوير الجذور الجانبية التي تعبر عن علامة غشاء البلازما وعلامة الأنابيب الدقيقة على فترات ساعة واحدة في غرف التصوير. كانت الجذور مستقرة للغاية في مواقعها ، مما يسمح بعدة ساعات من التصوير متحد البؤر.

لوحظت مؤشرات مرئية للانتشار طوال التجربة. في الخلايا الإنشائية ، يمكن تحديد كل من العصابات الأولية المسبقة والمغازل الانقسامية والبلاستيدات الابتدائية. على مدار ثلاثة أيام ، لم يكن نمو الجذر الجانبي مختلفا بشكل كبير في غرف التصوير مقارنة بألواح بتري خلال ال 48 ساعة الأولى ، ولكن بحلول 72 ساعة انخفض متوسط معدل النمو.

ومع ذلك ، لا تزال نسبة كبيرة من الجذور في الغرف تنمو بمعدلات مماثلة للجذور الموجودة على الأطباق على مدار 72 ساعة. بمجرد إتقان ، يمكن عمل شريحتين في 15 دقيقة إذا سارت الأمور بسلاسة. من الممكن استخدام نظام التصوير هذا لدراسة تأثير العلاجات الدوائية ، على الرغم من أن طرقا أخرى أكثر تعقيدا مثل أنظمة التروية مطلوبة لتجارب الغسيل.

بعد تطويرها ، وفرت هذه التقنية وسيلة رخيصة وبسيطة لمتابعة الأحداث الخلوية التي تقوم عليها تشكل النبات ، ولا سيما لاستكشاف دور حواف الخلايا ، والمتطلبات المكانية التي تشترك في تكوين الأعضاء في الجذور الجانبية ل arabidopsis thaliana.