Name: غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: استكشف تقنية التصوير المجهري متحد البؤر لتطوير الجذور والهيبوكوتيل في نباتات Arabidopsis thaliana. تتيح هذه الطريقة البسيطة مراقبة الأحداث الخلوية على مدى عدة أيام بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر البروفيسور جيفري واستينيس، جامعة كولومبيا البريطانية، للتعبير عن البذور رفب-TUB6 ومراجع مجهول للحصول على تصحيحات مفيدة. ونحن ممتنون للبروفيسور هيو ديكنسون لتنبيهنا إلى استخدام فيلم السليلوز كدعم ميكانيكي وجون بيكر للتصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل بمنح البحوث ببسك / بب / G013993 / 1 و بب / D004055 / 1 إلى إم، وجائزة تدريب الدكتوراه ببسرك ومنحة كلارندون إلى سك

1 - إنشاء الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطع الزجاج، وقطع 3 مم شرائح واسعة من نهاية شريحة المجهر 1 ملم. باستخدام سيانوكريلات فائقة الغراء أو الشريط على الوجهين، والغراء هذه الشرائط الزجاج ما يقرب من 45 ملم وبصرف النظر عبر عرض شريحة المجهر الثاني ( الشكل 1A ). مطلوب شريحة واحدة في الغرفة، بالإضافة إلى الشرائح الإضافية لصب ألواح أجار (شريحة واحدة سوف تسفر 2-3 ألواح أجار). يمكن إعادة استخدام الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين شرائط الزجاج، والأزياء طوقا من ارتفاع متطابقة من بولي إيثيلزيلوكسان بولي (غاما). وضع الكرة من بولي (ديميثيلزيلوكسان) الصمغ على الشريحة ( الشكل 1B )، الرطب شريحة ثانية مع كمية صغيرة من 100٪ من الايثانول المطلق، وتسطيح بولي (ديميثيلزيلوكسان) الكرة اللثة مع الشريحة الثانية حتى وصلت إلى الارتفاع من شرائط الزجاج ( الشكل 1C ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتقليم الزائدة بولي (الدايمثيلزيلوكسان) الصمغ مع شفرة حلاقة وتكرار تسطيح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القاطع مناسبة أو شفرة حلاقة المبللة في الايثانول المطلق، وإزالة الجزء الداخلي من الصمغ بولي (ديميثيلزيلوكسان) لخلق تجويف التي سوف تعقد في وقت لاحق الشتلات وبلاطة أجار ( الشكل 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم بعناية هلام مع شفرة حلاقة لخلق طوقا مع سمك الجدار النهائي ما يقرب من 2 مم ( الشكل 1E ). نفاذية الغازات من خلال حاجز بولي (ديميثيلزيلاكسان) مستقلة عن سمك فوق 50 ميكرون 11 . </li></ol> 2. إنشاء أجار-- صلابة بلاطة النمو المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة المجهر مع اثنين من شرائط الزجاج، ووضع ساترة (22 مم × 50 مم) بحيث تقع على كل من شرائط الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ذابت نصف القوة موراشيج وسكوغ متوسطة النمو تحتوي على 1٪ ث / س السكروز و 1.5٪ ث / الخامس أغار (½ مس) في الفضاء الناتجتحت ساترة حتى يتم شغل هذا الأخير تماما (حوالي 1 مل الحجم الكلي) وترك حتى يتم تعيين أجار (حوالي 5 دقائق). ملاحظة: المركبات الدوائية يمكن أن تدار من خلال لوح أجار بإضافة تركيزات مناسبة إلى وسط السائل قبل سكب بلاطة. وقد تم اختبار هذا بنجاح ل ديكساميثازون 12 ، إيزوكسابين، 2،6-ديكلوروبنزونيتريل (دسب)، أوريزالين، و لاترونكولين B. </li></ol> 3 - الانتهاء من إعداد غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء بتوازن بد عن طريق هز حجم صغير من بد في أنبوب 7 . إضافة كمية صغيرة (حوالي 200 ميكرولتر) من الهواء معاير بد إلى البئر من طوقا هلام، ولكن لا ملء الغرفة تماما. وهذا بد يساعد على تجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت لوح أجار كما يتم وضعها في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة من لوح أجار (في الخطوة 2.2 أعلاه) واستخدام شفرة حلاقة لقطع جزء من ديسيريد الحجم والشكل. ثم ضعه في بئر من طوقا هلام ( الشكل 1F ). يجب أن يكون هناك فجوة من 2-4 ملم إلى طوقا في جميع أنحاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة تماما مع الهواء معاير بد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع واحد أو أكثر من الشتلات A. ثاليانا (ما يصل إلى 3 شتلات للتصوير أكثر من 2-3 أيام) على لوح أجار مع كوتيليدونس وهيبوكوتيل معلقة على الحافة، وتطفو في بد ( الشكل 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الشتلات، تعقيم البذور مع 70٪ من الإيثانول، النبات على ½ مس المتوسطة تستكمل مع 1٪ السكروز و 0.8٪ أجار، ستراتيفي لمدة 2-4 أيام في 4 درجات مئوية، وتنمو على لوحات موجهة عموديا عند 22 درجة مئوية في 16 ساعة ضوء / 8 ساعة نظام الظلام. للجذور الجانبية التصوير، وتنمو النباتات لمدة 7-10 أيام قبل نقلها إلى غرف التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإغلاق الغرفة، وتطبيق ساترة مطابقة لبصريات الهدف، والضغط عليه بلطف أسفل حافة شريحة المجهر الزجاجي حتى ساترةويستند على كل من شرائط الزجاج ( الشكل 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين ساترة مع شرائط من 1.25 سم واسعة ميكروبور الشريط الجراحية قطع في نصف طول الحكمة على كل نهاية إذا رغبت في ذلك ( الشكل 1I ). السماح للعينة لتسوية لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير. هذا يقلل من حركة العينة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التصوير مع المجهر تستقيم للحفاظ على الركيزة تسيطر على النمو. استخدام أهداف 20X / 0.7NA أو 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol><li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22(2015).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/245021280_Solubility_of_oxygen_and_carbon_dioxide_in_water">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li>
<li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li>
<li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update%3A+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology%2C+physiology%2C+development+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140(2014).</li>
<li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378381204002717">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li>
<li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li>
<li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0376738814009466">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li>
<li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li>
<li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li>
<li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li>
<li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430(2011).</li>
<li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li>
<li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li>
<li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044(2017).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الطريقة المعروضة هنا هي استراتيجية بسيطة للتصوير مبائر عالية الدقة لتطوير الجذور الجانبية لمدة سنتين وتصل إلى ثلاثة أيام. لفترات تصل إلى 48 ساعة، لم يلاحظ أي آثار ضارة لنظام التصوير على تطوير الجذر الجانبي. بعد 48 ساعة، بدأ متوسط ​​نمو الجذر الجانبي في التباطؤ، على الرغم من أن مجموعة فرعية كبيرة من الجذور (37٪) استمرت في النمو بمعدلات مماثلة لمتوسط ​​نمو الجذور على الصفائح. لذلك، من خلال تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الجذور، الجذور التي تباطأ النمو بعد 48 ساعة يمكن استبعادها. لم يتم إجراء اختبارات منتظمة لغرف التصوير لفترات أطول من 72 ساعة، ولكن ينصح باستراتيجيات بديلة إذا كانت فترات التصوير الموسعة مطلوبة. يمكن ترك غرف التصوير على المسرح المجهر بشكل مستمر، إذا تم توفير الظروف البيئية المناسبة، أو إزالتها إلى منشأة النمو وعاد بشكل دوري إلى المجهر. هذا يسمح العديد من غرف ليتم تصويرها في موازاة. &lt;/ P&gt; ميزة واحدة من غرف وصفها هنا هو أن الجذور الجانبية ثابتة في موقفها ويمكن تصويرها باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. الاستقرار المكاني يعتمد بشكل حاسم على تركيز أجار المستخدمة في بلاطة أجار دعم. في البداية تم اختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من أجار 0.8٪ إلى 2٪ آجار، وكشف عن أن تركيزات عالية في هذا النطاق جذور ثابتة ثابتة في الفضاء، ولكن تباطؤ نمو الجذر بشكل أسرع وبعض الجذور عرضت علامات الإجهاد الميكانيكي، بما في ذلك انخفاض استطالة الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تركيزات أجار منخفضة لم توفر الدعم المطلوب وجذور انجرفت في x، y، z خلال التصوير. المثلى 1.5٪ أجار بلاطة يثبت موقف العينة دون آثار ميكانيكية ضارة. في ظل هذه الظروف، بعد تسوية في أول 30 دقيقة أو نحو ذلك، جذور مستقرة على مدى ساعات عديدة، مما يسمح الحصول على البيانات بين عشية وضحاها. أثناء الحصول على البيانات 4D، كانت نطاقات z- كومة عادة بمضرب من 5-10 ميكرون إضافية ولكن هذا كان أساسا لاستيعاب النمو خارج الطائرة من الجذور الجانبية بدلا من z-- الانجراف أو تمايل. على الرغم من أن تركيز أجار القياسية يوفر بعض المقاومة ضد الاختراق، والجذور المتنامية غرافيتروبيكالي في نهاية المطاف تخترق أجار. ومع ذلك، من خلال تعديل طفيف من غرفة التصوير، ويمكن الحفاظ على نمو الجذر موازية ساترة، مما يسمح للجذور الجانبية القديمة والجذور الأولية لتكون تصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكون مخصصة غرفة التصوير الأساسية ل هيبوكوتيلز. هيبوكوتيلز هي أكثر بحرية العائمة في هذا النظام بحيث تم زيادة قوس Z- محور للحصول على صورة عادة إلى حوالي 20 ميكرون. في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر تستقيم في جميع أنحاء، مما يسمح للخصائص الركيزة ليتم السيطرة عليها. غرفة التصوير قد تكون قابلة للتكيف مع تكوينات المجهر مقلوب ولكن التأثير على الوقت من ساترة جامدة على اعتراض الأجهزة تحتاج إلى تقييم. </p&gt; وقد أشار ليتلجوهن وزملاؤه إلى أن بد نفسها لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم المركبات الدوائية 7 . تم التغلب على هذه المشكلة عن طريق توريد مثل هذه المركبات من خلال بلاطة من وسط النمو المعزز الذي يقع على لوح أجار. في حين أن نظم نضح ستبقى الطريقة المفضلة للتجارب غسل التدريجي، وقد استخدمت غرفة التصوير بنجاح لإدارة ديكساميثازون 12 والمركبات الأخرى. ملاحظة واحدة، في حين أن هذه المادة في التحضير فون واجنهيم وزملاؤه 18 وصفت غرفة للتصوير تطوير الجذر الجانبي باستخدام ورقة الضوء المجهري.

لدراسة العمليات الخلوية والخلايا التي تكمن وراء تطوير النباتات، وهناك طلب متزايد على استراتيجيات التصوير عالية الدقة على المدى الطويل عالية الدقة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في تجارب التصوير هذه في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التبادل الغازي الكافي بالإضافة إلى إمدادات المياه والمغذيات 1 و 2 و 3 . لاستخدام الأهداف مع فتحات العددية العالية للقرار البصري الأمثل، وينبغي وضع العينات في مكان قريب وموجهة بالتوازي مع ساترة. الحركة في x، y، و z الاتجاهات يجب أن يكون الحد الأدنى خلال التصوير. في حين أن الشتلات غالبا ما يتم تركيبها في الماء أو محلول مائي للتصوير على المدى القصير، والماء لديه قدرة منخفضة لإذابة كو 2 و O 2 (1.54 ملغ / مل و 0.04 ملغ / مل، على التوالي عند 20 درجة مئوية، 0.1 ميجا باسكال) 4 ، مما يجعلفإنه غير مناسب لتجارب تمديد الوقت الفاصل. نظم الإرواء التي تحافظ على مستويات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية هي حل واحد لهذه المشكلة، وقد وضعت لكلا متحد البؤر المسح الضوئي بالليزر المجهري (كلسم) 1 ، 2 ، 3 والضوء ورقة المجهري (لسم) 5 . وقد صممت نظم مثل روتشيب 2 و روتاراي 3 خصيصا للتصوير الفاصل الزمني من الجذور النامية وتنطوي على بذور الإنبات في جهاز متعدد العينات بناء مخصص. هذه الترتيبات ضمان الحد الأدنى من الاضطرابات الميكانيكية ومصممة لتحليل مواز للشتلات متعددة، ولكن ليست الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية. وقد صممت كالدر وزملاؤه غرفة التصوير على أساس نضح أكثر تعقيدا الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية التي يقام العينة في موقف من قبل شبكةللسماح باستخدام العدسات التكبير الغمر عالية 1 . عرض هنا هو بديل، حل بسيط لهذه المشكلة التي لا تقوم على نظم نضح، ولكن يستخدم بيرفلوروديكالين (بد)، وهو بيرفلوروكربون التي اكتسبت شعبية مؤخرا كوسيلة متزايدة ل أرابيدوبسيس التصوير 6 ، 7 ، 8 . في هذه التطبيقات، والقدرة العالية لل بد لذوبان كو 2 و O 2 (1.9 غ / مل ل O 2 في بد مقارنة 0.04 ملغ / مل في الماء) 9 ، ويسمح التبادل الغازي من قبل الأنسجة مغمورة. وعلاوة على ذلك، بد هو غير الفلورسنت ومؤشر الانكسار (1.313) هو مقارنة مع الماء (1.333) وأقرب إلى أن من السيتوسول (~ 1.4) من الهواء (1.000) 6 . وقد تم الإبلاغ عن المركبات البيرفلوروكربونية لديها الحد الأدنى من التأثير الفسيولوجي على مجموعة متنوعة من النباتات والنباتات رالقضايا 6 ، مع بذور الفجل تنبت بسهولة عندما تغمر في بد ويظهر النمو الطبيعي والتنمية لمدة يومين على الأقل كامل أيام عند تزويده بالماء 10 . وقد أجريت ملاحظات مماثلة لإنبات بذور الأرابيدوبسيس 6 . استنادا إلى تحفيز رامان نثر مباشرة صورة توزيع بد في الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس بعد تسلل، ويخلص ليتلجون وزملاؤه أن بد من المرجح لا تؤخذ من قبل الخلايا الحية 8 . وقد استخدم بد في الغالب إلى الأنسجة الجوية صورة، حيث أنه يزيد بشكل كبير عمق التصوير لأنها تتسرب بسهولة الفضاء الجوي بسبب التوتر السطحي المنخفض 6 . هنا، يتم اعتماد بد للتصوير مبائر على المدى الطويل من تطوير الجذور الجانبية. في هذا التكوين، يتم وضع شتلة واحدة أو أكثر على لوح من وسط النمو تتعزز مع أجار ومغمورة في بد. و بد يسمح gتبادل عاصي في غرفة التصوير، ومنع نقص الأكسجين. بد هو متقلب للغاية لذلك يتم الاحتفاظ بها من قبل طوقا من الصمغ بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) التي لديها أيضا عالية نفاذية الغاز (1.5 × 10 -12 بمول م -1 ق -1 با -1 ل كو 2 ) 11 . المغذيات والمياه يتم توفيرها من قبل بلاطة متوسطة صلابة مع أجار. في نفس الوقت، هذا أجار بلاطة يضغط بلطف الجذر ضد ساترة، وبالتالي تحديد موقفها النسبي في غرفة التصوير والسماح باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. وعلاوة على ذلك، لوح أجار يمكن استخدامها لإدارة مجموعة من العلاجات الدوائية، بما في ذلك ديكساميثازون، أوريزالين، وإيزوكسابين. يمكن تجميع غرف التصوير بأعداد كبيرة من الشرائح المجهرية القياسية باستخدام الحد الأدنى من المعدات. وقد وضعت غرف التصوير واتسمت لدراسة التنمية الجذر الجانبي ولكن قابلة للتكيف لتصوير أجهزة الشتلات الأخرى مثل نصائح الجذر الأولية وhypocotyls.

<table><tbody><tr><td>بيرفلوروديكالين</td><td>F2 للكيماويات ، F2 للكيماويات المحدودة ، ليا تاون ، لانكشاير ، المملكة المتحدة</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) صمغ &nbsp ؛</td><td>كارولينا الإمداد البيولوجي. برلنغتون ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>البند # 132700</td><td>كارولينا جل</td></tr><tr><td>تجويف تجويف شرائح</td><td>VWR International Ltd ، Lutterworth ، &nbsp ؛ UK</td><td>10118-600</td><td>تجويف يبلغ قطره 13 مم وعمقه 0.2-0.4 مم. من المحتمل أن تكفي أي شريحة تجويف</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>أي "غراء فائق" مناسب للزجاج من المحتمل أن يكون كافيا</td></tr><tr><td>غشاء السيلوفان</td> السليلوزي <td>AA Packaging Limited ، Preston ، UK</td><td></td><td>325P فيلم السليلوز ؛ قرص 80 مم</td></tr></tbody></table>

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

العديد من جوانب التنمية النباتية، مثل التشكل الجانبي الجذر، تحدث على فترات زمنية من عدة أيام. لدراسة العمليات الخلوية والخلايا الكامنة وراءها، مطلوب استراتيجيات عالية الدقة الفاصل الزمني الفاصل الزمني التي تحافظ على الظروف الفسيولوجية. يجب أن يكون للأنسجة النباتية ما يكفي من المغذيات وإمدادات المياه مع تبادل الغاز المستمر، ولكن عندما غمرت وتجمد تحت ساترة، فهي عرضة بشكل خاص لنقص الأكسجين. إحدى الاستراتيجيات التي تم توظيفها بنجاح هي استخدام نظام نضح للحفاظ على إمدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية. غير أن هذه الترتيبات يمكن أن تكون معقدة ومرهقة وتتطلب معدات متخصصة. يعرض هنا هو استراتيجية بديلة لنظام التصوير بسيط باستخدام بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. هذا النظام من السهل اقامة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، ويتم تركيبها بسهولة على مرحلة المجهر، والسماح لعدة غرف التصوير ليتم إعدادها وتصويرها في قدم المساواةعلال. في هذا النظام، لا يمكن تمييز معدلات نمو الجذر الجانبي عن معدلات النمو في ظل الظروف القياسية على لوحات أجار لليومين الأولين، ويستمر نمو الجذر الجانبي بمعدلات منخفضة ليوم آخر على الأقل. يتم توفير الأنسجة النباتية مع المواد الغذائية عن طريق لوح أجار التي يمكن استخدامها أيضا لإدارة مجموعة من المركبات الدوائية. تم إنشاء نظام لرصد التنمية الجذر الجانبي ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى صورة الأعضاء النباتية الأخرى مثل هيبوكوتيلز والجذور الأولية.

المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر.

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

الهدف العام من نظام التصوير هذا هو استخدام المجهر الفلوري البؤري (confocal fluorescence microscopy) لمراقبة تطور أعضاء النبات على مدار عدة أيام بدقة دون خلوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في التشكل النباتي، مثل كيف تنسق خلايا الكائنات متعددة الخلايا أنماط نموها وتكاثرها أثناء تكون الأعضاء؟ تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في سهولة إعدادها وعدم اعتمادها على المعدات المتخصصة التي تُستخدم غالبًا في التصوير المتقطع (time lapse imaging)، مثل أنظمة التغذية المستمرة (profusion systems).جاءتنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما قرأنا منشور ليتلجون ولوف في مجلة New Phytologist والذي يصف مزايا مادة perfluorodecalin للتصوير داخل أنسجة الأوراق. للبدء، استخدم قاطع زجاج لصنع شرائح زجاجية بعرض ثلاثة مليمترات من شريحة بسمك واحد مليمتر. ثم، باستخدام غراء السيانوأكريليت أو شريط لاصق مزدوج الوجه، قم بتثبيت الشرائح بحيث تكون متباعدة بنحو 45 مليمترًا عبر عرض شريحة جديدة.قم بإعداد شريحة إضافية بنفس الأبعاد لتكون بمثابة قالب. الآن، اصنع حاشية بنفس الارتفاع من صمغ PDMS النفاذ للغازات. بلل شريحة ثانية بكمية قليلة من الإيثانول المطلق وقم بتسوية PDMS على الشريحة حتى يصل إلى ارتفاع الشرائح الزجاجية.بعد ذلك، بلل شفرة بإيثانول مطلق وقم بقص أي جزء زائد من الـ PDMS. هذه الخطوة حاسمة لأن الأدوات المبللة بالإيثانول لن تلتصق بالـ PDMS. ثم، قم بتسوية الـ PDMS مرة أخرى حتى يصل إلى ارتفاع الشريط.بعد ذلك، اصنع تجويفاً في الـ PDMS بحيث يتسع للشتلة وشريحة الآجار. وللحصول على حجم تجويف متسق، نستخدم قاطعاً منزلياً مصمماً خصيصاً ومصنوعاً من البيرسبكس، ولكن يمكن استخدام شفرة حلاقة بدلاً من ذلك. بعد ذلك، قم بالقص حول الحافة الخارجية لجعل الحشية بسمك حوالي مليمترين.الآن، قم بوضع غطاء شريحة فوق شريطي الزجاج على شريحة مجهرية خالية من حشية PDMS. ثم قم بنقل حوالي 1 ml من وسط الآجار المسال الدافئ باستخدام الماصة إلى المساحة الموجودة أسفل غطاء الشريحة، بكمية كافية لملء المساحة. يمكن أن يحتوي الآجار على المركبات التجريبية محل الدراسة.بعد ذلك، قم بموازنة بعض محلول PFD هوائياً عن طريق رج حجم صغير من PFD في أنبوب. وبمجرد تجمّد الآجار، ضع حوالي 200 µL من PFD في حاشية PDMS، ولكن لا تملأها بالكامل. ثم قم بإزالة غطاء الشريحة من شريحة الآجار، وقصها بالشكل الذي يناسب بئر حاشية هلام PDMS.اترك فجوة تتراوح بين مليمترين إلى أربعة مليمترات بين الآجار وجدار الحشية. بعد ذلك، املأ الحجرة بالكامل بـ PFD المتوازن هوائياً. ولتصوير الجذور الأولية ذات الانتحاء الجذبي، يتم استخدام غشاء سليلوزي كحاجز مادي على سطح شريحة الآجار.يجب أن تكون شريحة الآجار أكثر ليونة باستخدام 0.8% agar بدلاً من 1.5% agar. قم بقص قطعة من الغشاء بحيث تكون أبعادها تقريبياً نفس أبعاد كتلة الآجار. بعد ذلك، قم بتعقيمها باستخدام 80% ethanol واتركها لتجف في الهواء.بمجرد جفاف الغشاء، انقعه في وسط نمو سائل ثم انقله إلى سطح الآجار. للبدء، ضع بعناية ما يصل إلى ثلاث شتلات على الآجار، حيث يُعد وضعها أمراً بالغ الأهمية.يجب أن تتدلى الفلقات والسويقة تحت الفلقية فوق حافة الآجار، بحيث تكون طافية في PFD. كما يجب ترك مسافة بين الشتلات للسماح بنموها. ويمكن ثني الشتلات إذا كانت كبيرة جداً بحيث لا تتسع لها الغرفة.ثم أغلق الحجرة باستخدام غطاء شريحة بسمك يتناسب مع العدسة الشيئية المختارة. اضغط برفق على طول الحافة لضمان التلامس مع الشرائح الزجاجية. استخدم شريحة زجاجية أخرى للضغط برفق على غطاء الشريحة حتى يستقر بشكل متساوٍ على الشريحتين الزجاجيتين.بعد ذلك، قم بتثبيت غطاء الشريحة باستخدام شريط جراحي مسامي (micropore) مقطوع طولياً إلى نصفين. الآن، اترك العينة لتستقر لمدة نصف ساعة تقريباً قبل التصوير. ولتحضير شتلات Arabidopsis thaliana للغرف، قم أولاً بتعقيم البذور باستخدام الإيثانول بتركيز 70%.ثم ازرعها في وسط غذائي مضاف إليه مكملات. قم بعملية تبريد طبقي للبذور المزروعة لمدة يومين أو أربعة أيام عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، انقل البذور المزروعة إلى درجة حرارة 22 °C، واتركها تنمو في وضع رأسي تحت دورة ضوئية يومية مدتها 16 ساعة.لتصوير الجذور الجانبية، تُزرع النباتات لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أيام ثم تُنقل إلى غرف التصوير. وقد تم توثيق الجذور الجانبية التي تنمو بمعدلات فسيولوجية في غرف التصوير كل نصف ساعة. كما زُرعت الجذور الجانبية أيضاً على أطباق بتري قياسية في الوسط نفسه لأغراض المقارنة.تباين معدل نمو الجذور الفردية بشكل كبير في كلا الإعدادين، ولكن كان النطاق متشابهاً تحت أي من condition. وبشكل عام، زاد معدل النمو مع زيادة الطول. ولم يكن هناك فرق يمكن تمييزه في معدل نمو النباتات داخل غرف التصوير أو على الأطباق خلال أول 27 ساعة من النمو.بدأت كلتا المجموعتين بنفس متوسط طول الجذور الجانبية. تم تصوير الجذور الجانبية التي تعبر بشكل مشترك عن واسم غشاء بلازمي وواسم أنيببات دقيقة على فترات زمنية مدتها ساعة واحدة في غرف التصوير. كانت الجذور مستقرة للغاية في مواقعها، مما سمح بإجراء تصوير بؤري لعدة ساعات.تمت ملاحظة المؤشرات المرئية للتكاثر طوال فترة التجربة. وفي الخلايا المرستيمية، أمكن تحديد كل من نطاقات ما قبل الطور التمهيدي، والمغازل الانقسامية، والجدار الخلوي الأولي (phragmoplasts). وعلى مدار ثلاثة أيام، لم يختلف نمو الجذور الجانبية في غرف التصوير بشكل ملحوظ مقارنة بأطباق بيتري خلال أول 48 ساعة، ولكن بحلول الساعة 72 انخفض متوسط معدل النمو.ومع ذلك، فإن نسبة كبيرة من الجذور في الغرف استمرت في النمو بمعدلات مماثلة للجذور الموجودة على الأطباق على مدار 72 ساعة. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إعداد شريحتين في غضون 15 دقيقة إذا سارت الأمور بسلاسة. ومن الممكن استخدام نظام التصوير هذا لدراسة تأثير العلاجات الدوائية، على الرغم من أن هناك حاجة إلى طرق أخرى أكثر تعقيداً مثل أنظمة التروية لإجراء تجارب الغسل.بعد تطوير هذه التقنية، وفرت وسيلة رخيصة وبسيطة لتتبع الأحداث الخلوية التي تدعم التشكيل المورفولوجي للنبات، وبوجه خاص لاستكشاف دور حواف الخلايا، والمتطلبات المكانية التي يتشاركها تكوين الأعضاء في الجذور الجانبية لنبات arabidopsis thaliana.

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

تنص هذه المادة على بروتوكول للزراعة شتلات Arabidopsis في RootChip، منصة التصوير ميكروفلويديك الذي يجمع بين التحكم الآلي من شروط النمو مع مراقبة جذر المجهرية والحنق القائم على قياس مستويات الأيض داخل الخلايا.

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

وصفنا باستخدام بروتوكول الشرائح غرفة وسائل الاعلام الى شل النبتات مصنع للتصوير مبائر للبشرة على مدى عدة أيام للتنمية وتوثيق التمايز الثغور. يمكن تتبع البروتينات Fluorophore الموسومة بشكل حيوي بواسطة التعبير وتوطين التحت خلوية، وزيادة فهم أدوارهم ممكن خلال انقسام الخلايا وتمايز الخلايا من نوع.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

ويستخدم المجهر متحد البؤر لصورة مخاليط البوليمر الغروانية هادئة وتتدفق، والتي يتم دراستها كما نظم نموذج للمعلقات جذابة. وتستخدم خوارزميات تحليل الصور لحساب المقاييس الهيكلية وديناميكية للالجسيمات الغروية التي تقيس التغيرات بسبب الحبس هندسية.

التصوير متحد البؤر المحصورة من هادئة ويتدفق مخاليط البوليمر المادة الغروية

كاليفورنيا 2+ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني 2+ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم 2+ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا 2+ إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

يوضح هذا البروتوكول طريقة تحضير عينة نباتية للفحص المجهري للصفائح الضوئية. يتميز الإعداد بتركيب النبات عموديا على سطح الجل وتركه ينمو في ظروف مشرقة خاضعة للرقابة. هذا يسمح بمراقبة طويلة الأمد لتطور أعضاء النبات في ظروف موحدة.

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

يوضح هذا المقالة كيفية الثقافة شتلات نبات التمويل في منصة طبقتين موائع جزيئية أن يحصر الجذر الرئيسي والشعر الجذر لطائرة بصري واحد. يمكن استخدام هذا البرنامج للتصوير الضوئي في الوقت الحقيقي مورفولوجيا الجذر غرامة كذلك أما بالنسبة للتصوير عالي الدقة بوسائل أخرى.

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

يمكننا وصف أسلوب التحقيق في القدرة على نصيحة زراعة الخلايا النباتية، بما في ذلك أنابيب حبوب اللقاح، وجذور الشعر، وموس بروتونيماتا، تمديد عبر الفجوات ضيقة للغاية (~ 1 ميكرومتر) في جهاز موائع جزيئية.

تطوير أجهزة موائع جزيئية لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في المساحات الصغيرة للغاية

ويقدم هذا البروتوكول كيفية العيش الصورة وتحليل الخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار من الأنواع النباتية المختلفة باستخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل].

[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة

هنا نحن وصف بروتوكول للتصوير الخلية الحية من القشرية المجهرية cytoskeleton في تبادل لاطلاق النار meristem apical ورصد استجابتها للتغيرات في القوات المادية.

حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

تستخدم هذه العملية المجهر الكونفوكلي بالتزامن مع نواة فلورية وخط علامة كروماتين في الأرابيدوبسيس ثاليانا لتسجيل ديناميكيات النواة والكروماتين في جذور الأرابيدوبسيس ودراسة التغيرات في هذه الديناميكيات استجابة للإشارات التطورية والبيئية.

التصوير الكمي للخلية الحية لشكل النواة وديناميكيات الكروماتين أثناء التطور والإجهاد البيئي في جذر الأرابيدوبسيس ثاليانا

استكشف تقنية التصوير المجهري متحد البؤر لتطوير الجذور والهيبوكوتيل في نباتات Arabidopsis thaliana. تتيح هذه الطريقة البسيطة مراقبة الأحداث الخلوية على مدى عدة أيام بدقة عالية.

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

استكشف المزيد من الفيديوهات