نمذجة السلوك سرطان المبيض متعددة الخلايا الجسم الشبه الكروي في Microdevice دينامية 3D البريتوني

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء منصة ديناميكية للزراعة المشتركة القائمة على الموائع الدقيقة لمحاكاة البيئة داخل الصفاق مع المكونات الخلوية والميكانيكية التي يحدث فيها ورم خبيث لسرطان المبيض. باستخدام هذا الميكرو لهذه المنصة ، فإنه يساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، مثل البيئة المكروية لنشر الصفاق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد تحت التدفق الحر الذي يتم التحكم فيه بدقة تحاكي بشكل أفضل الاتصال في الجسم الحي بين خلايا سرطان المبيض وخلايا الميثوثيديا التي تحدث في التجويف البريتوني.

بعد تصميم ورسم نمط قناة الموائع الدقيقة وإنتاجه وفقا لبروتوكول النص ، قم بتدوير طبقة من SU82075 مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون بسرعة دوران تبلغ 1800 دورة في الدقيقة. اخبزي الرقاقة المطلية بمقاومة الضوء مباشرة على طبق ساخن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة لإزالة المذيبات الزائدة.

قم بتدوير طبقة ثانية من SU82075 Photoresist على الرقاقة بسماكة نهائية تبلغ 250 ميكرومتر. ضع الرقاقة المطلية بمقاومة الضوء مباشرة على لوح ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة سبع دقائق ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل تبريد الرقاقة ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بمحاذاة قناع الصورة وضعه مباشرة فوق الرقاقة.

ثم قم بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 ثانية لعبور طول النمط. على طبق ساخن ، اخبزي الرقاقة المطلية على حرارة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة لإزالة المذيب للتحضير. قم بإزالة المقاوم الضوئي غير المتقاطع عن طريق غمر الرقاقة في مطور SU8 لمدة 25 دقيقة.

ثم باستخدام الأيزوبروبانال ، اشطف الرقاقة واستخدم الهواء المضغوط لتجفيفها. اجمع بين قاعدة Polydimethylsiloxane أو PDMS وعامل المعالجة بنسبة كتلة 10 إلى واحد واستخدم خلاط الطرد المركزي تحت وظيفة الخلط وإزالة الغاز لخلط المحلول. صب خليط PDMS ببطء على الرقاقة على ارتفاع حوالي خمسة ملليمترات.

قم بإزالة PDMS في مجفف فراغ لمدة 40 دقيقة. ثم قم بمعالجة PDMS في الفرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بتقشير لوح PDMS بعناية من اللوحة الرئيسية وقم بقص PDMS على طول القنوات حتى يصبح حجم الشريحة الزجاجية.

ثم باستخدام ثقب خزعة بحجم ملليمتر واحد ، قم بثقب PDMS لإنشاء مداخل ومخارج الجهاز. استخدم الهواء المضغوط لتنظيف سطح PDMS ثم باستخدام شريط لاصق ، قم بإزالة الغبار وحطام PDMS. الآن ضع لوح PDMS بحيث يكون جانب القناة متجها لأعلى في منظف البلازما.

ثم ضع شريحة زجاجية نظيفة في منظف البلازما بجانب لوح PDMS. عالج PDMS والشريحة الزجاجية تحت بلازما الهواء بتردد راديو عال أو مستوى التردد اللاسلكي لمدة دقيقة واحدة. ثم بعد إزالة العينات من منظف البلازما ، اربط PDMS بالشريحة الزجاجية لإنشاء رابطة تساهمية لا رجعة فيها.

ضع شريحة PDMS على لوح ساخن عند 150 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتعزيز قوة الترابط وإعادة الكراهية للماء ل PDMS قبل الاستخدام. لطلاء قنوات الموائع الدقيقة بالفبرونكتين ، ابدأ باستخدام 30 لترا صغيرا من الإيثانول بنسبة 75٪ لتعقيم القنوات. قم بإزالة الإيثانول واستخدم PBS لشطف القنوات مرتين.

ثم استنشق PBS جيدا من القنوات. قم بإعداد 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول الفيبرونيكتين في وسط M199MCDB105 خال من المصل مع 30 ميكرولتر من المحلول ، واملأ القنوات ببطء واستخدم الشريط اللاصق لإغلاقها. ثم احتضان الرقاقة عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

لزرع خلايا الظهارة المتوسطة البريتونية الأولية أو HPMCs في قنوات الموائع الدقيقة ، بعد شطف الخلايا المستنبتة وفقا لبروتوكول النص ، استخدم ملليلترين من وسط ثقافة FBS بنسبة 10٪ لإعادة تعليق HPMCs. باستخدام مقياس كثافة الدم ، عد الخلايا واضبط تركيز الخلية إلى 3.5 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. قم بتسخين شريحة الموائع الدقيقة المغلفة بالفيبرونكتين في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل الاستخدام.

ثم قم بشفط محلول الفيبرونيكتين بالكامل وقم بسحب 30 ميكرولترا من تعليق HPMC ببطء في كل قناة. استخدم شريطا لإغلاق القنوات ووضع الجهاز في حاضنة CO2 طوال الليل. للحث على تكوين كروي لسرطان المبيض ، قم بإذابة 0.5٪ agarose في ماء معقم.

قم بتوزيع 50 ميكرولترا من محلول الاغاروز في آبار 96 لوحا جيدا. بعد عد الخلايا السرطانية الظهارية البشرية المزروعة مسبقا ، أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة FBS بنسبة 5٪ بكثافة 5،000 خلية لكل ملليلتر. انقل 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر مغلف بالأغروز.

وزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. انقل الكرويات السرطانية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر مبلل مسبقا بملليلتر واحد من الوسط الخالي من المصل وقم بتدوير الكرات عند 750 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد تحضير 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول CMFDA في وسط M199MCDB105 خال من المصل.

أعد تعليق الكرات الكروية السرطانية في مليلتر واحد من المحلول واحتضان الكرات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم احسب الرقم الكروي واستخدم وسيطا خاليا من المصل لضبط التركيز على 2 ، 000 كروي لكل مليلتر. قبل التحميل الكروي ، قم بحقن 100 ميكرولتر ببطء من وسط M199MCDB105 الخالي من المصل لغسل خلايا الظهارة المتوسطة غير الملتصقة داخل القنوات.

قم بتحميل 30 ميكرولترا من نظام التعليق الكروي المزود بالفلورسنت في كل قناة. ثم ضع شريحة الموائع الدقيقة في حاضنة CO2. قم بتجميع منصة وفيرة عن طريق توصيل حقنة محملة بمتوسط M199MCDB105 طازج خال من المصل بأنبوب طوله متر واحد.

ضع المحقنة على مضخة الحقنة وقم بتأمين المكبس وجسم المحقنة. ثم قم بتثبيت مضخة الحقنة في وضع أفقي بنفس ارتفاع شريحة الموائع الدقيقة داخل الحاضنة. قم بغرس الأنبوب بالكامل بسرعة بالوسيط عن طريق الضغط مع الاستمرار على زر التقديم السريع حتى يفيض الوسط في الأنبوب.

ثم قم بتشغيل الحقن بمعدل التدفق المطلوب. قم بتوصيل الأنبوب بمدخل القناة وفقا لبروتوكول النص. ثم استخدم أنبوبا قصير الإخراج لتوصيل مخرج القناة بأنبوب مخروطي حجم 50 مليلتر لتجميع وسط التدفق الخارج.

أخيرا ، استخدم مجرا ساطعا أو مجهر مضان لمراقبة HPMCs والكرات السرطانية. باستخدام منصة الموائع الدقيقة الموصوفة في هذا الفيديو ، تم نمذجة كرويات سرطان المبيض بخلايا الظهارة المتوسطة في ظل الظروف الهيدروديناميكية. كما هو موضح في هذا الشكل ، نجحت الخلايا المتوسطة الظهارية التي تمت زراعتها في الجهاز الدقيق لمدة 16 ساعة في تشكيل طبقة أحادية من HPMCs.

في هذه التجربة ، تم تصنيف الكرات الكروية متعددة الخلايا بأقطار حوالي 100 ميكرومتر والتي تشبه في الحجم تلك الموجودة في مجتمعات المرضى بصبغة فلورية خضراء CMFDA. ثم تم نقل الكرويات إلى قنوات الموائع الدقيقة المطلية ب HPMC وظلت معلقة وتم التقاط أشكال الخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في عدة ساعات على مدار ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

واحد من كل 10 في هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب إدخال فقاعات الهواء في قنوات الموائع الدقيقة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل العلاج الدوائي ، ومقايسات الالتصاق ، وفحوصات إزالة الظهارة المتوسطة للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل تأثير البيئة المكروية داخل الصفاق على تطور السرطان. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لاستكشاف الرم البريتوني عند البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء جهاز دقيق بريتوني مع تدفق سائل لبدء سلوك سرطان المبيض في التجويف البريتوني. لا تنس أن العمل مع الكبريت العضوي مثل الأسيتون ، كمطور وأسطوانة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ تحذيرات MP مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند إجراء هذا الإجراء لأول مرة.

يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تتعامل مع هذا المكتب تحت غطاء شديد.