علاج الرباط ينشأ مع مصل مكيفة مكيفة: نموذج هندسة الأنسجة الانتقالية

الهدف العام من هذا النموذج هو تحديد تأثير التمرين والتغذية على تخليق النسيج الضام ووظيفته. تستخدم هذه التقنية مصل بشري يؤخذ قبل التمرين وبعده من أجل علاج الأنسجة ثلاثية الأبعاد ، حتى نتمكن من فهم كيفية تأثير التمرين على وظيفة الأربطة والأوتار. يجمع ضمان الأنسجة ثلاثية الأبعاد بين فوائد المقايسات المميزة جيدا في المختبر مع الوظيفة والتشكل والخصائص الكيميائية الحيوية للأنسجة في الجسم الحي.

بعد تحضير ألواح 35 ملم مطلية بالسيليكون مسبقا وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد قوالب التثبيت عن طريق وضع دبوس صغير واحد في وسط كل بئر أسطواني في القوالب. اجمع بين فوسفات بيتا ثلاثي الكالسيوم ومحلول حامض الستريك الفوسفوريك بمعدل واحد إلى ثلاثة جرام لكل مليلتر في قارب وزن بلاستيكي على الجليد. استخدم مكشطة خلية بلاستيكية لخلط الأسمنت بقوة.

قم بتقطيع الأسمنت لمواصلة الخلط ، وقم بتقطيع الخليط في القوالب ، ثم قم بالطرد المركزي للقالب المملوء عند 2 ، 250 مرة جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، اسمح لمثبتات الأسمنت بالفرشاة بالضبط في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة المراسي من القالب وقم بتثبيت مرساتين ، على بعد 12 ملم في كل لوحة مطلية بالسيليكون.

بتعقيم الألواح المثبتة عن طريق رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وملء كل من الألواح والأغطية ، ثم ضع الألواح في خزانة السلامة البيولوجية ، أو BSC. بعد 30 دقيقة على الأقل ، قم بشفط الألواح واسمح لها بالتجربة في BSC. استبدل الأغطية وقم بتخزينها في BSC لحين الحاجة.

الامتثال للوائح المخاطر البيولوجية المحلية للاستخدام السليم والتخلص من المواد الخطرة بيولوجيا. حافظ على العقم وقم بتنفيذ خطوات تكوين البناء في خزانة السلامة البيولوجية. بعد تحضير الخلايا الليفية الأولية والكواشف والألواح المطلية بالسيليكون مع مثبتات الفرشاة المثبتة ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بزراعة الخلايا في ألواح 15 سم إلى التقاء 70٪.

بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي يتكون مما يلي ، 681 ميكرولتر لكل بنية من تعليق الخلية ، و 29 ميكرولتر لكل بناء من الثرومبين ، وميكرولترين لكل بناء من البروتينين ، وميكرولترين لكل بناء من حمض أمينوهكسانويك. بعد خلط المحلول جيدا ، أضف 714 ميكرولترا إلى كل لوحة مثبتة بنمط الشكل ثمانية حول مثبتات الأسمنت بالفرشاة ، مما يضمن أن المزيج الرئيسي يتصل مباشرة بجوانب المراسي. اضغط برفق على كل طبق لتوزيع المزيج بالتساوي.

الخطوة الأكثر أهمية هي تشكيل هلام الفيبرين الموجود في الخلية. تأكد من أن المزيج الرئيسي للجلوس الخلوي يتصل مباشرة بالمثبتات ، واضغط على اللوحة لتوزيع الخليط بالتساوي. طبق واحد في كل مرة ، أضف 286 ميكرولترا من الفيبرينوجين بطريقة متساوية على اللوحة.

حرك اللوحة على الفور ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع الفيبرينوجين لتشكيل المواد الهلامية الفيبرينية المضمنة في الخلية ، ثم انتقل إلى اللوحة التالية. ضع التركيبات في حاضنة معقمة يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، واحتضنها لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح ببلمرة الفيبرينوجين. قم بإعداد ملليلترين لكل بناء من وسط العلف عن طريق استكمال وسط النمو ب 200 ميكرومول من حمض الأسكوربيك ، و 50 ميكرومول من البرولين ، وخمسة نانوغرام لكل مليلتر من TGF beta 1.

استخدم ملليلترين من وسط التغذية لتغطية كل بناء ، واستزراع التركيبات في حاضنة معقمة يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 14 يوما ، أو إلى نقطة النهاية المرغوبة ، وتحديث الوسط كل يومين بملليلترين من وسط التغذية. لجمع المصل البشري ، ارسم عينة دم أثناء الراحة وفقا لبروتوكول النص ، ثم اطلب من المشاركين أداء طريقة من التمرين تناسب هدفك البحثي. يظهر هنا نوبة 30 دقيقة من تمارين المقاومة عالية الكثافة.

اجمع عينة دم بعد 15 دقيقة من جلسة التمرين ، ثم بعد السماح للدم بالتجلط ، قم بتدوير العينة عند 1،500 مرة جم لمدة 10 دقائق. في ظل ظروف معقمة ، انقل المصل إلى أنابيب معقمة لإعداد الوسائط. بعد تحضير تركيبات الأربطة ، قم بإجراء اختبار الشد باستخدام جهاز اختبار الشد في حمام PBS مع مقابض مصبوبة عكسية مقترنة بمحول القوة.

يثبت مثبتات الأسمنت الفرشاة في مكانها أثناء الاختبار. باستخدام الفرجار الرقمي ، حدد طول وتركيب الرباط ، واحسب مساحة المقطع العرضي للأنسجة. قم بفك تثبيت بنية الرباط من اللوحة ، وضع المراسي في المقابض المصبوبة العكسية ، مع التأكد من غمر الهيكل في PBS ، ثم اضبط المسافة بين المقابض ، وضبط طول البناء على طوله الأولي.

ابدأ الاختبار ، وقم بتصفية البناء حتى يفشل بمعدل إجهاد يبلغ 0.4 ملم في الثانية ، أو 3٪ في الثانية. بعد الاختبار ، قم بمعالجة الأنسجة وإجراء قياس الكولاجين للأربطة الهندسية وفقا لبروتوكول النص. بعد يوم إلى يومين في المزرعة ، ارتبطت الخلايا الليفية في الرباط الصليبي الأمامي بهلام الفيبرين ، وعمليات الخلايا الممتدة ، وبدأت في ممارسة قوى الجر.

يتولد التوتر بين نقطتي الربط ، وتحذي الخلايا بالتوازي مع هذا المحور ، وتبدأ في ترسيب الكولاجين. يظهر هنا مخطط إجهاد إجهاد تمثيلي للرباط الذي تم اختباره حتى الفشل. في هذه التجارب ، تم عزل المصل البشري من عينات الدم قبل التمرين وبعده واستخدامه بدلا من FBS لتوليد وسائط غنية بالبيئة الكيميائية الحيوية التي يسببها التمرين.

كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، بعد فترة استزراع مدتها 14 يوما ، أظهرت تركيبات الأربطة زيادة كبيرة في كل من حمل الشد الأقصى ومحتوى الكولاجين استجابة لمصل ما بعد التمرين. بمجرد إتقانها ، يمكن عمل تركيبات الأربطة على مدار يومين ، وستكون جاهزة لاختبار الشد ، وقياس محتوى الكولاجين ، والتحليلات الكيميائية الحيوية الأخرى في غضون أسبوعين. يعد هذا النموذج الانتقالي في المختبر جزءا من مهمة أوسع لفهم كيف تعمل التمرين على تحسين وظيفة الأربطة والأوتار ، وفي الواقع ، كل نسيج في الجسم تقريبا.

لذا فهذه تقنية قوية وقوية حقا حيث يمكننا تحديد محتوى الكولاجين ووظيفة النسيج الضام بعد العلاجات بالتمارين الرياضية والتغذية والتحميل وأي نوع من عوامل النمو وجميع أنواع التدخلات المختلفة التي يمكننا القيام بها في البشر أو.